溶菌酶活力测定及其体外抑菌试验

Abstract:ThefeedingexperimentandthedigestiontrialwereconductedtoevaluatethenutritionvalueofpigletdietfermentedbyLactobacillusplantarumN3′FLFonweaningpiglets.Theproductionperformance,serumbiochemicalparameter,histologicalpa-rameterandapparentdigestibilityofnutritioncomponentsweredeterminedtodiscusstheaffectingmechanismsofLactobacillusplan-tarumN3′FLFontheperformanceofweaningpiglets.Keys:LactobacillusplantarumN3;weaningpiglets;productionperformanceEffectofLactobacillusPlantarumN3′FLFontheProductionPerformanceofWeaningPigletsLIUJinping1,WANGShichang2(1.VeterinaryResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou510640,PRC;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530005,PRC)溶菌酶(Lysozyme)是一种能够水解细胞壁成分中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键的酶,在作用时可观察到溶菌现象,因此而得名。溶菌酶化学性质非常稳定,当pH值在1.2～11.3的范围剧烈变化时,结构几乎不变。在酸性环境下溶菌酶对热的稳定性很强,pH值在4～7,100℃处理1min仍能保持原有活性。溶菌酶广泛存在于卵清、唾液、生物液体中,动物组织、植物组织、微生物中也有溶菌酶的存在。溶菌酶本身是一种无毒、无害、无残留,安全性很高的天然蛋白质。近几年随着研究的不断深入,发现来源不同的溶菌酶,其作用机制也有所不同。本试验采用不同来源的溶菌酶进行体外抑菌试验,通过对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌观察及与常用抗生素的初步比较,可为溶菌酶在畜禽疾病治疗、促进生长等方面的应用提供参考。为了加强其溶菌作用,将溶菌酶与中草药提取液制成复合制剂,检测复合制剂中溶菌酶的活力,为进一步开发应用提供依据。1!"#$%1.1材料1.1.1溶菌酶溶菌酶1:根据张文全[1]的方法提取鸡蛋清溶&’():2006-07-11+,-.:黑龙江省科技攻关项目(GC03B506)/012:刘纹芳(1962-),女,黑龙江人,本科,副研究员,主要从事饲料添加剂开发与应用方面的研究。溶菌酶活力测定及其体外抑菌试验刘纹芳1,曲琪环2,陆黎敏2,鹿保鑫3(1.456789:;<=>?@,BCD150030;2.456789:;F9G,BCD150030;3.IJKLM6N89OP9G,IJK8Q163319)ST:将溶菌酶与中草药提取液配制成复合制剂,测定复合制剂中溶菌酶的活力。结果与单一溶菌酶活力比较差异不显著(P>0.05)。用不同来源的溶菌酶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行体外抑菌试验,并与常用抗生素进行比较。结果溶菌酶对金黄色葡萄球菌抑菌效果明显,与青霉素钠及硫酸丁胺卡那霉素比较无明显差异。溶菌酶对大肠杆菌的抑菌效果因来源不同而有所差异。UVW:溶菌酶;活力测定;抑菌试验XYZ[\:Q55;Q814]^_‘a:A]bc\:1001-0084(2006)10-0005-03!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!fg>?-5-饲料博览2006年第10期菌酶,自市场购买新鲜鸡蛋。溶菌酶2:购于杭州康源技术开发有限公司。1.1.2中草药提取液取自制的中草药100g加水1～2L,浸泡30min煎煮,煮沸后文火继续煎30min,滤出煎液,共煎2次,合并滤液,最后将药液用文火浓缩至100mL(药液中生药含量为1g·mL-1),装瓶,高压灭菌备用。1.1.3溶菌酶复合制剂将溶菌酶1和溶菌酶2与中草药提取液配制成复合溶菌酶制剂1和复合溶菌酶制剂2。1.1.4金黄色葡萄球菌及大肠杆菌金黄色葡萄球菌3株、大肠杆菌2株由东北农业大学微生物实验室提供。1.1.5牛肉膏琼脂培养基蛋白胨10g、牛肉膏3g、琼脂粉17.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL。将除琼脂以外的各成分溶于蒸馏水内,加热煮沸,过滤。加入15%氢氧化钠溶液约2mL,校正pH值7.4～7.6。加入琼脂粉,使琼脂溶化。烧瓶中分装,121℃高压灭菌15min后备用。1.1.6试剂D152弱酸性阳离子交换树脂(南开化工厂),青霉素钠(哈药集团制药总厂,80万IU·支-1),硫酸丁胺卡那霉素(齐鲁制药有限公司,20万IU·支-1),蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉(上海化学试剂公司),溶菌酶品(哈尔滨奕博尔科技有限公司,2万IU·mg-1),溶壁微球菌(MicrococcusLysodeikticus菌种编号1.0634)购于中国科学院微生物研究所菌种中心,化学试剂皆为国产分析纯。1.1.7仪器高效液相色谱仪,752分光光度计,超净工作台,真空冻干机,电热恒温培养箱,电热鼓风干燥箱,压力蒸气锅,摇床,电子天平,电子显微镜等。1.2方法1.2.1溶菌酶的活力测定采用文献[2]的方法。将溶菌酶及其复合制剂用0.1mol·L-1磷酸钾缓冲液(pH=6.2)稀释至适当浓度,以一定浓度的溶壁微球菌悬浮液为底物,加入待测酶液0.5mL,于450nm的波长下测吸光度的变化。以每毫克溶菌酶每分钟使吸光度降低0.001个单位为一个酶活力单位U。1.2.2试验用菌液的制备分别取大肠杆菌标准株、金黄色葡萄球菌标准株接种于牛肉膏斜面培养基上,37℃培养,24h后进行涂片,革兰氏染色,镜检,确定菌株。将斜面上的菌接种到营养肉汤中,37℃培养24h,比浊管比浊,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌含量分别为48亿个·mL-1,30亿个·mL-1,4℃冰箱保存备用[3]。1.3抑菌试验采用平板打孔法检测药物对试验用菌的作用效果。在直径9cm的无菌平皿中加入1mL菌液,倒入冷却到50℃溶化的牛肉膏琼脂培养基15mL,充分混匀。待琼脂凝固后,用外径6mm的无菌金属管在琼脂上等距离打孔3个,并挖出孔内琼脂培养基,然后于每孔中滴加少量0.5%琼脂封底。于每孔中各自加入不同种及不同浓度的药物0.05mL。将平皿置于37℃温箱内培养24h后取出。用游标卡尺测量抑菌圈的大小。抑菌试验的分组方法见表1。1.4试验数据的处理显著性检验采用t检验。2!"2.1溶菌酶活力测定结果2.1.1溶菌酶的定性检测分析高效液相色谱仪的检测图,溶菌酶标准品出现吸收峰值的时间为4.75min,自制鸡蛋清溶菌酶出现吸收峰值的时间为4.20min,溶菌酶标准品与自制鸡蛋清溶菌酶出现最高峰的时间极为接近,证明为同一种物质。自制的鸡蛋清溶菌酶与所购买的溶菌酶标准品比较,出现峰值的区间是一样的,但是自制的鸡蛋清溶菌酶的基线却始终在零线的上方,说明提取的溶菌酶中还存在一些杂蛋白。2.1.2溶菌酶活力测定溶菌酶活力测定结果见表2。复合溶菌酶制剂的酶活力与单一溶菌酶酶活力比较差异不显著(P>组别抑菌剂1青霉素钠2硫酸丁胺卡钠霉素3中草药提取液4溶菌酶15溶菌酶2#1$%&’()&’*+饲料博览2006年第10期-6-0.05)。将溶菌酶配成复合制剂后不影响酶活力。2.2抑菌试验结果溶菌酶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌结果见表3。抑菌结果,溶菌酶对金黄色葡萄球菌表现良好的抑菌效果(抑菌圈直径大于19mm)。与抗生素、中草药提取液比较同样达到敏感程度。溶菌酶对大肠杆菌的抑菌效果明显弱于对金黄色葡萄球菌的抑菌效果,而且对大肠杆菌的抑菌效果低于抗生素和中草药提取液。两种溶菌酶比较,来源于微生物的溶菌酶2对大肠杆菌的抑菌效果优于鸡蛋清溶菌酶。3!"目前,养殖动物的疾病防治中仍以应用抗生素为主,随着人们对畜产品卫生安全的重视,寻求替代抗生素的产品已成为趋势。溶菌酶作为一种天然蛋白质,对动物无毒、无害,不会在体内残留,有很好的生物相融性,是一种非常有应用价值的产品。为使其抗菌谱更广,增强溶菌酶效力的发挥,应考虑配伍使用。在本试验中与中草药提取液配合,没有影响溶菌酶的活力。它们配合应用的配合比例及抑菌效果还有待进一步研究。另外,溶菌酶来源广乏,可以从动物、植物、微生物中提取。来源不同时其作用机制也有所不同,当使用目的不同时,应考虑其来源[4]。[#$%&][1]张文会,王艳辉,马润宇.离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶[J].食品工业科技,2003(6):57-59.[2]施特尔马赫.酶的测定方法[M].钱嘉渊,译.北京:中国轻工业出版社,1992.[3]徐叔云,卞如濂.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,1985.[4]叶丹,连宾.溶菌酶及其应用[J].贵州科学,2003,21(3):67-70.’2()*+,-./0(X±S,n=6)稀释后溶菌酶浓度(!g·mL-1)ΔOD450溶菌酶活力(U·mg-1)溶菌酶150.048±0.00149666.67±273.25复合溶菌酶制剂150.045±0.00229033.33±445.72溶菌酶2100.050±0.00274950.00±273.86复合溶菌酶制剂2100.047±0.00154716.67±147.20Abstract:Thelysozymeactivityofcompoundagentmadebymixinglysozymewithherbextractingliquidwasdeterminedandcomparedwithsinglelysozyme,thedifferencewasnotsignificant(P>0.05).TheantibacterialtestinvitrowasconductedwithlysozymeofdifferentsourcesandstaphylococcusandE.coliindairycowandcompareditwithnormalantibiotic.TheresultsshowedthatLysozymewasverysensitivetostaphylococcusandhadnosignificantdifferencecomparedwithantibiotic.TheeffectonE.coliwasdifferentwithdifferentsourceoflysozyme.Keywords:lysozyme;activitydetermination;antibacterialtest组别抑菌剂抑菌圈直径金黄色葡萄球菌大肠杆菌1青霉素钠(1000IU·mL-1)27.6-2硫酸丁胺卡钠霉素(400IU·mL-1)26.323.63中草药提取液18.517.14溶菌酶1(5000U·mL-1)19.310.15溶菌酶2(5000U·mL-1)21.215.54356789(;<=)mmActivityDeterminationofLysozymeandAntibacterialTestinvitroLIUWenfang1,QUQihuan2,LULimin2,LUBaoxin3(1.InstituteofAnimalNutrition,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,PRC;2.CollegeofVeterinaryMedicine,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,PRC;3.CollegeofFood,HeilongjiangAugustFirstLandReclamationUniversity,DaqingHeilongjiang163319,PRC)>?@A-7-饲料博览2006年第10期