13-异亮氨酸

第十三章异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵第一节分支链氨基酸的生物合成途径和代谢调节机制在L型异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val）的分子中，都具有由甲基侧链形成的分枝结构（见13-1），故称上述三种氨基酸为分枝链氨基酸（branchedchainaminoacids）。分枝链氨基酸是合成蛋白质的素材，可以作为生物体的能源，也作为生物体成分的前体。但是，高等动物不能合成这三种氨基酸，故Ile、Leu、Val称为必需氨基酸。目前，分枝链氨基酸主要用作氨基酸输液的原料。表13-1分枝链氨基酸的结构名称结构式分子式分子量异亮氨酸（Ile）C6H13O2N131.18亮氨酸（Leu）C6H13O2N131.18缬氨酸（Val）C5H11O2N117.15Ile分子内有两个不对称碳原子，因而，Ile存在着D、L、D别、L别四种光异构体（表13-2）。很难用化学合成法，或用化学合成法与酶法相组合的方法，廉价制造纯度高的L型Ile。Leu与Val分别只有两个光学异构体，能够用化工合成、酶法分割的方法，较廉价地制造。要廉价生产高纯度的L型Ile，只有采用发酵法，因此，Ile发酵就成了分枝链氨基酸发酵的中心问题。然而，从自然界中，只找到了分泌Leu或Val的菌株，却找不到分泌Ile的菌株。直到20世纪60年代后半期，随着氨基酸生物合成系反馈调节机制的全部搞清，可以通过选育目的氨基酸代谢拮抗物抗性株的方法，从遗传上解除原菌株的反馈调节机制，从而可以利用这种抗性菌株，由糖直接发酵生产Ile（Leu或Val）。表13-2Ile的四种光学异构体L-IleD-IleD-别IleL-别Ile一、生物合成途径1960年，经过用粗糙链孢霉、大肠杆菌的营养缺陷型突变株，及用放射性同位素标记的前体，进行研究的结果，确定了Ile、Leu及Val的生物合成途径（图13-1）。出于VaI和Leu的所有碳原子，都来自于丙酮酸，所以，Val及Leu亦称丙酮酸族氨基酸。Ile的六个碳原子中的四个碳原子来自于ASP，所以，Ile与Thr、Lys、Met一起，亦称作ASP族氨甚酸。Umbarger等研究的结果，清楚地说明，不仅L-Thr是Ile的前体，D-Thr及α-氨基丁酸也是Ile的前体。并且指明，由D-Thr等物质生成α-酮基丁酸的酶，不受反馈抑制。因此，可以用D-Thr或α-氨基丁酸发酵制造Ile。分支链氨基酸的生物合成途径如图13-1所示。图13-1分支链氨酸生物合成途径及其调节机制由图13-1可以看出，异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸这3种分支链氨基酸是从苏氨酸、丙酮酸经过若干步酶促反应而合成的。可以看出，L-苏氨酸是异亮氨酸的直接前体，丙酮酸是缬氨酸的直接前体，由缬氨酸合成途径的中间体α-乙酰异戊酸分支合成亮氨酸。在合成异亮氨酸、缬氨酸的途径中，有4步反应的酶是共用的，即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶、二羟基脱水酶及分支链氨基酸转氨酶。它们分别催化异亮氨酸及缬氨酸生物合成途径中互相对应的反应。例如，乙酰乳酸合成酶既催化异亮氨酸合成途径中由α-酮丁酸生成，α-乙酰-α-羟基丁酸的反应，又催化缬氨酸合成途径中由活性乙醛和丙酮酸生成α-乙酰乳酸的反应。此外，分支链氨基酸转氨酶不仅能催化异亮氨酸和缬氨酸的合成，而且也能催化亮氨酸的合成，也就是说，异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成途径中的最后一步转氨基反应，都是由同一种转氨酶催化完成的。二、代谢调节机制研究表明，在粘质赛氏杆菌中，分支链氨基酸生物合成的代谢调节机制如图13-2所示。图13-2粘质赛氏杆菌中分支链氨基酸生物合成的调节机制由图13-2可以看出，Ile合成中的第一个限速酶是L-Thr脱氨基酶，第二个限速酶则是乙酰羟基酸合成酶。Va1合成中的限速酶是乙酰基酸合成酶，也就是Ile合成中的第二个限速酶。Leu合成中的限速酶是α-异丙基苹果酸合成酶。限速酶的不同，就意味着目的产物合成所受的代谢调节不同。然而，随着微生物种类的不同，限速酶的调节因子也不同，就现有的研究情况来说，粘质赛氏杆菌的代谢情况了解得较为全面，这种细菌的分枝链氨基酸合成的代谢调节方式，跟大肠杆菌相类似。其他菌种的代谢调节方式只是部分地了解。分支链氨基酸生物合成的代谢调节机制如下。(1)苏氛酸脱氨酶受异亮氨酸的反馈抑制。(2)α-乙酰乳酸合成酶受缬氨酸的反馈抑制。(3)α-异丙基苹果酸合成酶受亮氨酸的反馈抑制。(4)分支链氨基酸合成酶系的各个酶的生成，受这3种末端氨基酸——异亮氨酸+缬氨酸+亮氨酸的多价阻遏。编码3个分支链氨基酸合成酶系的基因组成两个主要的操纵子：ilv(左)和1eu(右)操纵子（图13-3)。位于图距85min的ilvGEDACB操纵子中，DACB基因编码异亮氨酸、缬氨酸2个途径共用的4个多功能酶：基因C和D编码乙酰乳酸异构还原酶的亚基和二羟基脱水酶。基因B、G和E则分别编码乙酰乳酸合成酶亚基Ⅰ、Ⅱ和缬氨酸转氨酶。基因A编码苏氨酸脱氨酶。它们的控制区也分别处在B与C、C与A和E与G基因之间。亮氨酸合成途径酶系由leu操纵子编码：基因A编码异丙基苹果酸合成酶，基因D、C编码α-异丙基苹果酸异构酶，基因B编码β-异丙基苹果酸脱氢酶。leuDCBA操纵子被靠近结构基因A的调节区所控制。处于图距2min的ilvH、I操纵于编码同功酶乙酰乳酸合成酶亚基Ⅲ。图13-3大肠杆菌leu（右）ilv(左)操纵子的组织结构在ilvGEDACB操纵子中，转录时GEDA产生一条mRNA，而C和B则不和它一起转录。编码Ⅲ型合成酶的结构基因ilvH、I则位于2min处，但都受该途径终产物的阻遏。此外，所有的结构基因产物都可能受到多价阻遏，但是，无论是用遗传的方法还是生化的方法都未能鉴定出阻遏物，所以目前认为ilv和leu操纵子表达的控制可能主要通过衰减机制。1eu操纵子控制区的全部核苷酸序列已经测出。经分析发现，Pribnowbox居于前导转录物起始转录位点之前，此前导转录物具有编码28个氨基酸残基的能力。其上含有的4个连续的leu密码子，无疑也是在翻译水平上起调节作用的、除非亮氨酰－tRNAleu与翻译的核搪体处在这点(指4个leu密码子处)上空转时被隔离开来。如此，转录便向前，一组基因开始表达。另外，还含有3个异亮氨酸和3个缬氨酸密码子，显示着前导肽上这些氨基酸的有效性可能影响1eu操纵子的表达。1eu前导转录物除含有能够产生前空白子(A—A)、终止子(B—B)和保护子(D—D)的二级结构外，还存在一种能阻止前空白于形成并且引起操纵子衰减的附加序列(additionalsequence)D—D。由于D—D首先形成，此操纵子将会总是处于衰减状态，除非核糖体在那里破坏D—D配对，并且A—A也不配对。运转的核糖体需要精确的密码排列，如果只在leu密码子处发生空转，那么在加个ilv－val第一个双密码子处空转的核糖体不能使操纵子去阻遏，而且在第二个ilv-val双密码子处空转的核糖体也都不能去阻退，因为它阻止了前空白子(A—A)的形成。这就对多价阻遏产生了某些怀疑，实际上，这很可能就是多价衰减。ilv操纵子表达的程度好像取决于一个以上核糖体沿前导RNA的移动速率，而亮氨酰、缬氨酰和异亮氨酰－tRNA的有效性决定着这种移动速率。核糖体的移动将促进前导转录物结构上发生动力学的变化，显示着可能引起终止子茎环结构的形成。当所有氨酰-tRNA都存在时，核糖体沿前导肽平滑地移动，直到它遇上隐藏终止密码的碱基配对形成茎环结构Z—Z为止。这种终止便给出了足够的时间形成终止子，以致发生衰减作用。第二节异亮氨酸发酵1901年，Fischer在由蛋白水解液分离的亮氨酸组分中发现了旋光度较亮氨酸更大的物质，此为有关L-异亮氨酸的最早报道。L-异亮氨酸（L-Isoleucine），化学名为β-甲基-α-氨基戊酸。由于在α位和β位具有两个不对称碳原子，因而存在D、L、D别、L别四种旋光异构体，但自然界中存在的异亮氨酸为L-异亮氨酸，其余三种均无营养价值。由于存在四种旋光异构体，因此很难采用化学合成法或化学合成与酶法相结合的方法，廉价制造高纯度L-异亮氨酸，只有采用发酵法。然而，自然界中只找到了分泌L-亮氨酸和L-缬氨酸的菌株，却未发现分泌L-异亮氨酸的菌株。直到20世纪60年代后半期，随着氨基酸生物合成体系反馈调节机制的全部搞清，才人工选育出L-异亮氨酸产生菌。一、L-异亮氨酸生产方法L-异亮氨酸生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三类，但目前在工业生产上实施的主要是发酵法。由于化学合成法生产的L-异亮氨酸与其它异构体分离困难，因而未能实现工业化生产。发酵法就是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累L-异亮氨酸，包括添加前体物发酵法和直接发酵法两类。1添加前体物发酵法又称微生物转化法。这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加特异的前体物质即在氨基酸生物合成途径中的一些合适中间代谢产物，以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸。图13-4L-异亮氨酸合成前体由于其前体物质稀少或价格昂贵，目前已很少采用此法生产L-异亮氨酸。2直接发酵法直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。目前，异亮氨酸产生菌大多由谷氨酸产生菌黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）、乳糖发酵短杆菌（BrevibacteriumLactofermentas）诱变选育而来。二、L-异亮氨酸生产概况目前国际上日本生产L-异亮氨酸占有垄断地位，厂家有味之素、协和发酵和田边制药三家，均以发酵法生产，产酸率达30~35g/L，提取率60~70%。目前全世界合计年产量400~500吨。鉴于L-异亮氨酸生产的高难度，L-异亮氨酸一直是高价氨基酸。我国的L-异亮氨酸发酵研究始于20世纪70年代，90年代初正式工业化生产。目前，传统一次投糖分批发酵大罐产酸率为20~22g/L，总得率为40~50%。与日本相比较，我国的L-异亮氨酸生产水平还较低(如表13-3所示)。表13-3我国与日本L-异亮氨酸发酵技术指标的比较生产技术指标日本中国产酸率(g/L)30~3520~25对糖转化率(%)20~2513~15提取收率(%)60~7560三、L-异亮氨酸产生菌育种策略及实例（一）L-异亮氨酸产生菌常规育种策略根据L-异亮氨酸生物合成途径及代谢调节机制（如图13-1和图13-2所示），L-异亮氨酸高产菌应具备以下生化特征：1.CO2固定反应能力强；2.天冬氨酸合成酶能力强；3.天冬氨酸激酶活力强；4.高丝氨酸脱氢酶活力强；5.苏氨酸脱氨酶活力强；6.乙酰羟基酸合成酶活力强；7.二氢吡啶-2，6-二羧酸合成酶活力微弱或丧失；8.琥珀酰高丝氨酸转琥珀酰酶活力微弱或丧失；9.谷氨酸脱氢酶活力弱。选育L-异亮氨酸产生菌应该从以下几方面着手：1.切断或减弱支路代谢通过选育营养缺陷型和渗漏突变型可以切断或减弱支路代谢。营养缺陷型是指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养时外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。由于其在合成途径中某一步骤发生缺陷，致使终产物不能积累，因此，也就遗传性地解除了终产物的反馈调节，使得中间产物或另一分支途径的末端产物得以积累。另外，它还可以起到节省碳源的作用。渗漏突变型就是指遗传性障碍不完全的缺陷型。由于这种突变是使它的某一种酶的活性下降而不是完全丧失，因此，渗漏突变型能够少量地合成某一种代谢终产物，能在基本培养基上进行少量的生长。由于渗漏突变型不能合成过量的最终产物，所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。1）切断或减弱蛋氨酸的合成支路。蛋氨酸比苏氨酸优先合成，蛋氨酸合成过量后才使代谢转向合成苏氨酸，进一步合成L-异亮氨酸，因此切断或减弱蛋氨酸的合成支路有利于高产L-异亮氨酸。可选育蛋氨酸营养缺陷型Met-或MetL(渗漏突变)。2）切断或削弱赖氨酸合成支路。选育赖氨酸缺陷型或渗漏突变株，即切断或减弱由天冬氨酸半醛（ASA）向赖氨酸的合成支路。一方面可以起到节省碳源的作用，另一方面可以解除其对天冬氨酸激酶(AK)的反馈抑制，使代谢流更加流畅，造成异亮氨酸的前体物苏氨酸大量积累，从而使异亮氨酸的积累量提高。3）切断或减弱亮氨酸合成支路。选育亮氨酸缺陷或渗漏突变株，既可以解除亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸对分支链氨基酸生物合成酶系的多价阻遏，又可以避免不利于异亮氨酸精制操作的副产物氨基酸—正缬氨酸和高异亮氨酸的生成，从而有利于目的产物异亮氨酸的积累。这些副生氨基酸由α-酮丁酸、α-酮-β-甲基戊酸经亮氨酸生物合成途径生成，为亮氨酸所调节。所以，对于异亮氨酸生产菌株来说，如能增加亮氨酸缺陷这一遗传标记，就可以不生成正缬氨酸和高异亮氨酸，从而达到改良生产菌株的目的。2.解除菌体自身反馈调节通过以下措施可以解除菌体自身反馈调节：　　1）选育抗结构类似物突变株。抗类似物突变株也称为代谢拮抗物抗性突变株。选育抗结构类似物突变株是目前代谢控制发酵育种的主流。选育抗结构类似物突变株，因为代谢调节可被遗传性地解除，在发酵时可不再受培养基成分的影响，生产较为稳定。另外，抗结构类似物突变株不易发生回复突变，因此在发酵生产上被广泛采用。（1）选育苏氨酸结构类似物抗性突变株，如α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）抗性、苏氨酸氧肟酸盐（ThrHx）抗性突变株，可解除苏氨酸对高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制。（2）选育赖氨酸结构类似物抗性突变株，如S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)抗性突变株，可解除赖氨酸和苏氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制。（3）选育异亮氨酸结构类似物抗性突变株。苏氨酸脱氨酶是异亮氨酸生物合成途经中的关键酶，受异亮氨酸的反馈抑制。选育α-氨基丁酸抗性（α-ABr）、异亮氨酸氧肟酸盐抗性(IleHxr)、硫代异亮氨酸抗性(S-Iler)、三氟代亮氨酸抗性(TFLr)、α-噻唑丙氨酸抗性(α-TAr)、邻甲基-L-苏氨酸抗性(OMTr)、β-羟基亮氨酸抗性(β-HLr)、α-溴丁酸抗性及D-苏氨酸抗性突变株，可以遗传性地解除异亮氨酸对苏氨酸脱氨酶的反馈调节，从而有利于异亮氨酸的积累。（4）选育蛋氨酸的结构类似物抗性突变株，如乙硫氨酸（Eth）抗性突变株，可解除蛋氨酸对高丝氨酸脱氢酶的反馈阻遏作用。（5）选育缬氨酸结构类似物抗性突变株，可解除支链氨基酸对乙酰羟基酸合成酶的协同反馈阻遏和缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制。2）营养缺陷型回复突变株的应用。当难于找到合适类似物或由于菌株的多重抗性交叉难以增加抗性标记时，或反馈调节很复杂时，可采用由营养缺陷型选育回复突变株的方法来选育高产菌株。一个菌株由于突变而失去某一遗传性状后，经过回复突变可以再恢复其原有的遗传性状。这是因为当某一结构基因发生突变后，该结构基因所编码的酶就因结构的改变而失活。而经过第二次突变（回复突变）后，该酶的活性中心结构可以复原，而调节部位的结构常常并没有恢复。结果是一方面酶恢复了活性，而另一方面反馈抑制却已解除或不那么严重。因此，可以利用营养缺陷型的回复突变株来提高发酵产品的产量。例如，选育丧失苏氨酸脱氨酶的回复突变株，一方面恢复了苏氨酸脱氨酶的活性，另一方面，异亮氨酸对苏氨酸脱氨酶的反馈抑制已被解除或不严重，结果使L-异亮氨酸产量得到提高。3.增加前体物的合成增加目的产物的前体物的合成，有利于目的产物的大量积累。1）增加前体物苏氨酸的合成由代谢途径可以看出，苏氨酸是异亮氨酸的前体物。为了大量积累异亮氨酸，除了设法解除异亮氨酸生物合成的反馈调节外，还应设法解除对其前体物苏氨酸生物合成的反馈控制，增强苏氨酸的生物合成能力，从而提高异亮氨酸的积累量。已知苏氨酸和异亮氨酸生物合成途经的关键酶—高丝氨酸脱氢酶（HD）受苏氨酸的反馈抑制，为了解除苏氨酸对HD的反馈调节，可选育α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）抗性突变株，结果可获得异亮氨酸积累量达15g/L的高产菌株。据报道，选育苏氨酸氧肟酸盐抗性（ThrHxr）、α-氨基月桂基内酰胺抗性(ALLr)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸抗性(AECr)等有利于苏氨酸积累的突变株，也可增加异亮氨酸的积累量。另外，选育高丝氨酸脱氢酶缺陷的回复突变株，也有利于异亮氨酸的积累。2）增加天冬氨酸的合成（1）强化CO2固定反应。选育以琥珀酸为唯一碳源快速生长的突变株，以琥珀酸为唯一碳源，如果菌体生长、碳代谢只走四碳二羧酸反应，生长越快，四碳二羧酸脱羧酶系越强；而四碳二羧酸脱羧反应与CO2固定反应所用酶是同一酶，所以以琥珀酸为唯一碳源，如果菌体生长快，则CO2固定反应就强。（2）选育天冬氨酸结构类似物抗性突变株。天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶存在着反馈抑制作用，天冬氨酸合成过量后反馈抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，使天冬氨酸生物合成的速度减慢或停止，所以，必须解除天冬氨酸对磷酸烯酸式丙酮酸羧化酶的反馈抑制。选育抗天冬氨酸结构类似物(如天冬氨酸氧肟酸盐AspHxr，二甲基嘌呤)突变株可达到目的。（3）选育磺胺胍（SG）抗性突变性。磺胺胍是天冬氨酸的结构类似物，天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶存在着反馈抑制作用，天冬氨酸合成过量后反馈抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，使天冬氨酸生物合成的速度减慢或停止，所以，选育磺胺胍抗性解除了天冬氨酸对磷酸烯酸式丙酮酸羧化酶的反馈抑制，使代谢流更加通畅。同时，SG是四氢叶酸的抗代谢物，四氢叶酸是叶酸的衍生物，它是一碳化合物的载体，以辅酶的形式参与蛋白质和核酸的代谢过程，对甲基的转移、甲酸基和甲醛基的利用起重要作用。4.切断进一步代谢途径要大量积累异亮氨酸，需要切断或减弱异亮氨酸进一步向下代谢的途径，使积累的异亮氨酸不再被消耗。据报道，选育不能以异亮氨酸为唯一碳源生长，即丧失异亮氨酸分解能力的突变株，有助于异亮氨酸的大量积累。（二）L-异亮氨酸产生菌育种实例Shiio等首先由黄色短杆菌选育α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）抗性突变株，获得一株L-异亮氨酸产生菌AR1-129，可积累11g/L的L-异亮氨酸；从AR1-129出发进一步选育邻甲基苏氨酸抗性(OMTr)突变株，产酸率提高到１4.5g/L。Ikeda等以产L-苏氨酸11g/L的L-苏氨酸产生菌FAB-3-1（AHV和AEC双重抗性）为亲株选育乙硫氨酸（Eth）抗性突变株，获得几乎不积累L-苏氨酸而积累L-异亮氨酸的变异株No.14083。由10%葡萄糖可产11g/L的L-异亮氨酸，如果通过流加醋酸进行发酵，可产L-异亮氨酸33.5g/L。吉永文弘由黄色短杆菌选育AHV、Eth、AEC多重抗性突变株，在培养期间流加1:0.2比率的醋酸与醋酸铵混合液（70g/100mL，以醋酸计），维持培养液pH7.7。经96h发酵后，可生成L-异亮氨酸37.4g/L。中国科学院微生物研究所唐任天等以钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)AS1.542为出发菌株，经亚硝基胍（NTG）诱变处理，获得了AHV抗性突变株AS1.998，其生长不再受外加的L-异亮氨酸抑制；在含10%葡萄糖、4%硫酸铵、0.1%磷酸氢二钾、0.75%玉米浆、0.5%麸皮水解液、4.5%CaCO3的培养基中，接种量2.5%，振荡培养3d，L-异亮氨酸积累量达14g/L。沈阳药学院微生物研究所刘党生等，以谷氨酸产生菌天津短杆菌(Brevibacteriumtianjinese)T6-13为出发菌株，经硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)等诱变处理，逐级选育AHV、AEC和Eth等氨基酸结构类似物多重抗性突变株AS111并采用均匀设计方法考察了9种培养基组成对L-异亮氨酸发酵的影响，获得优化培养基配比为12%葡萄糖、2%硫酸铵、0.1%磷酸二氢钾、0.45%磷酸氢二钾、0.055%硫酸镁、1μg生物素、15μg硫铵素、2ppm硫酸亚铁、2ppm硫酸锰、4%碳酸钙、pH7.0-7.2。在此条件下，菌株AS111可产L-异亮氨酸15.1g/L。天津氨基酸公司张磊等利用IABS模型以L-异亮氨酸产生菌AS111为出发菌株，有目的地活化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PC）、高丝氨酸脱氢酶(HD)和乙酰羟基酸合成酶(AS)等酶，筛选获得α-氨基丁酸抗性(α-AB)、以琥珀酸为唯一碳源平板生长(Sucg)和乙硫氨酸高抗(Ethhr)，在优化培养条件下可产L-异亮氨酸20g/L。无锡轻工业学院张炳荣等以乳糖发酵短杆菌为出发菌株，经DES和UV诱变处理，在AHV、AEC、Eth、异亮氨酸氧肟酸盐（IleHx）等氨基酸结构类似物及琥珀酸（Suc）为唯一碳源的平板上定向筛选，获得一株L-异亮氨酸高产菌ZT-2（AHVr+AECr+Sucr+Ethr+IleHxr），在合适的条件下可产L-异亮氨酸24g/L。天津科技大学陈宁等以黄色短杆菌HL41为出发菌株，通过硫酸二乙酯（DES）和紫外线诱变处理，经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代，筛选出一株L-异亮氨酸生产菌株TC-21(Met－+Ethr+α-ABr+AECr)，该菌株在10L发酵罐上发酵84h可积累L-异亮氨酸25.0g/L。四、代谢工程与L-异亮氨酸工程菌的构建代谢工程是指应用DNA重组技术和应用分子生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，经过改变酶的功能和输送体系的功能，甚至产能体系的功能，以改进微生物细胞某些方面的代谢活性的整套工作（包括代谢分析，代谢设计，遗传操作，目的代谢活性的实现等）。代谢工程的目标是修饰初级代谢，将碳架物质流导入目的产物的载流途径以获得产物的最大转化率。随着代谢工程与各种学科知识的融合，越来越多的研究方法和策略被应用于代谢工程的研究。1）基于代谢工程的氨基酸工程菌构建的具体思路代谢工程的具体思路和常规诱变育种技术有所不同。（1）改变代谢流：改变分支代谢途径的流量，阻断有害产物。可采取如下措施：　a.加速限速反应。通过克隆对生物合成起限速作用的关键酶基因，加速代谢流的流动。b.构建代谢旁路。用代谢工程的方法可以阻断或降低副产物的合成，特别是有毒产物的产生。c.改变能量代谢途径。d.改变分支代谢途径的流量。通过提高代谢分叉点的某一个分支代谢途径酶系的活力，以得到高产的末端代谢产物。（2）扩展代谢途径和构建新的代谢途径：通过引入外源基因，可以延伸原来的代谢途径，产生新的末端代谢产物，或者利用新的底物作为生物合成的原料，也可构建新的代谢途径来合成具有新化学结构的代谢产物。a.延伸代谢途径。b.构建新的生物合成途径。2）基于代谢工程策略构建L-异亮氨酸高产菌从理论上讲，氨基酸工程菌的构建策略有下列几种：第一，借助于基因克隆与表达技术，将氨基酸生物合成途径中的限速酶编码基因导入生产菌中，通过增加基因剂量和（或）更换表达调控条件，扩增其表达。导入的限速酶基因既可以是生产菌自身的内源基因，也可以是来自非生产菌（如大肠杆菌）的外源基因；第二，采取类似的方法，扩增表达氨基酸输出系统的关键基因，或者降低某些基因产物的表达速率，最大限度地解除氨基酸及其生物全合成中间产物对某生物合成途径可能造成的反馈抑制；第三，将多种完整的氨基酸生物合成操纵子导入另一种氨基酸的生产菌中，构建能同时生成两种甚至多种氨基酸的工程菌。实施上述战略的第一步是有关基因的克隆。谷氨酸棒杆菌中ilv操纵子如图13-3。氨基酸生物合成基因的克隆大都采用突变株互补的方法，在大肠杆菌的营养缺陷型突变株中构建谷氨酸棒杆菌的基因文库，然后通过遗传互补正向筛选，即可克隆相关基因。L-异亮氨酸是从L-苏氨酸转化而来的，整个合成过程包括五步反应，分别由苏氨酸脱氨酶（ilvA）、乙酰羟基酸合成酶（ilvBN）、异构还原酶（ilvC）、二羟酸脱水酶（ilvD）以及转氨酶B(ilvE)催化，这些酶中只有苏酸氨酸脱氨酶是L-异亮氨酸生物合成特异性的，其它4种酶也参与L-缬氨酸和L-亮氨酸的生物合成。肠道内至少存在5种乙酰羟基酸合成酶的同功酶，与之相比，谷氨酸棒杆菌只有一种，碳源从L-苏氨酸到L-异亮氨酸的流向实际上是由苏氨酸脱氨酶和乙酰羟基酸合成酶控制的，最后3种酶无论是在酶活水平还是在基因水平上均不参与L-异亮氨酸生物合成的调控。对于谷氨酸棒杆菌的L-苏氨酸脱氨酶而言，L-异亮氨酸是一个变构抑制因子，而缬氨酸则是变构激活因子。乙酰羟基酸合成酶的活性可被三种支链氨基酸反馈抑制50%左右，谷氨酸棒杆菌的乙酰羟基酸合成酶在细胞中受到严格控制，而且调控水平存在于基因的转录阶段。由于在大量的突变工作中从未分离到含有这两个关键酶抗调节的突变株，因此L-异亮氨酸工程菌的构建策略主要是解除L-苏氨酸脱氨酶或（和）乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制。谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱氨酶基因的克隆及测序为这项工作提供了有利条件，借助于定点突变技术，可将该酶的变构功能域转变成抗反馈抑制的序列。例如将该酶的第323位氨基酸残基由Val转变为Ala，L-异亮氨酸对突变酶的反馈抑制全部解除，使其始终处于活化状态。若将这个基因导入L-异亮氨酸的生产菌中，并使之过量表达抗反馈抑制的苏氨酸脱氨酶，则工程菌的L-苏氨酸合成系统转换成L-异亮氨酸的生成系统，培养液中的L-异亮氨酸浓度可达20g/L。Komatsubara等采用L-异亮氨酸产生菌F803的染色体DNA，通过鸟枪法克隆，分离得到重组质粒pTK120。此重组质粒在pLG339上含有7.5kb插入片段，并携带包括ilvA2突变的4种ilv基因。将质粒pIK120导入野生型菌株Mu-910和菌株T-803的细胞中。导入pTK120后显著的提高了苏氨酸脱氨酶和乙酰羟基酸合成酶的活性。采用具有thr重组质粒的工程菌株以提高L-异亮氨酸的产酸率。得到携带pSK301的菌株T-803，在48h或72h添加蔗糖，其重组菌株T-803(pSK301)可产L-异亮氨酸32g/L。Sahm等为获得谷氨酸棒杆菌的L-异亮氨酸高产菌株，对L-异亮氨酸的生物合成途径中相应的酶进行了基因扩增，即通过基因克隆增加基因剂量。以赖氨酸高产菌株为亲株，扩增已经对反馈调节不敏感的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶的相应基因，打通从天冬氨酸半醛到高丝氨酸的通道，结果大量积累苏氨酸。然后将失去反馈调节作用的苏氨酸脱氨酶进行基因扩增，苏氨酸被转化成L-异亮氨酸，产量可达30g/L。S.Guillouet等从大肠杆菌中分离到了对L-异亮氨酸反馈抑制不敏感的分解代谢苏氨酸脱氨酶。不同于由基因ilvA编码的基因，该酶基因为tdcB，并能被AMP激活。大肠杆菌在厌氧条件下在只含有高浓度氨基酸而不含有葡萄糖的培养基中良好生长时能产生这种酶。当这种异源基因被导入野生型谷氨酸棒杆菌并获得表达时，发现该菌在200mmol/L的L-异亮氨酸的存在下仍能保持60%的苏氨酸脱氨酶活性，而野生型菌株在15mmol/L的L-异亮氨酸存在下酶活性就已被抑制。将此谷氨酸棒杆菌的异源基因扩增，即增加基因剂量，则工程菌的L-异亮氨酸产量能比野生型菌株提高50倍；而如果将谷氨酸棒杆菌本身的苏氨酸脱氨酶基因扩增，则L-异亮氨酸产量只比野生型菌株提高4倍。碳平衡数据表明，上述异源酶基因的扩增使得70%的碳源从赖氨酸途径改向L-异亮氨酸途经，因而大大提高了L-异亮氨酸产量。五、发酵法生产L-异亮氨酸提高生产菌株的L-异亮氨酸产量不仅取决于控制机制被解除的程度，发酵的外界环境对产量也有着重要影响。异亮氨酸生物合成的代谢调节的解除，说明所选突变株具备了大量积累异亮氨酸的潜在能力，而不能说这些突变株在任何条件就一定能在发酵生产上取得高产。实际结果，发酵的环境条件，如：培养基组成、pH、温度、溶氧水平等都明显的影响异亮氨酸的产量。以天津科技大学陈宁等选育的黄色短杆菌突变株SW0370（Leu-+Met-+α-ABr+AECr）发酵法生产L-异亮氨酸为例说明其发酵工艺。该菌种以黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）HL41为出发菌种,选育出具有亮氨酸缺陷（Leu-）、蛋氨酸缺陷（Met-）、α-氨基丁酸（α-ABr）、S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性（AECr）遗传标记的突变株SW0370。种子培养基（g/L）为：葡萄糖35，硫酸铵3，KH2PO4·3H2O1.5，MgSO4·7H2O0.4，FeSO4·7H2O0.01，MnSO4·H2O0.01，豆饼水解液15mL，玉米浆15mL，VH0.5mg，VB12.5mg，尿素2.0，pH7.0~7.2。把10支左右试管（18×180）斜面种子接入5L发酵罐中的1500mL种子培养基中，用2mol/L的HCl与25%的氨水调节pH在7.0，溶氧为20～30%（以饱和亚硫酸钠中的溶氧为0，以空气中的溶氧为100%），31oC培养20h左右，稀释20倍菌体净增浓度△OD620nm0.6以上，以接种量10%，接入10L罐的发酵培养基（g/L）中（葡萄糖75，(NH4)2SO415，FeSO4·7H2O15mg/L，MgSO4·7H2O400mg/L，MnSO4·1H2O15mg/L，KH2PO41.5，K2HPO43.0，VH140μg/L，VB10.1mg/L，Met20mg/L，豆饼水解液20mL，玉米浆25mL，pH7.1~7.3）。发酵过程中，用HCl与25%氨水调节pH使之在32h之前维持7.0，之后维持7.2；发酵温度开始31oC，OD620增加到1.1时降温到28oC，直到发酵结束；溶氧在OD620增加到1.1时，维持在30%以上之后，维持在20%左右，植物油作为消泡剂,发酵过程泡沫较多时，通过消泡泵手动加入已灭菌的消泡剂消泡；补料分批发酵时，当残糖低于1.5时流加灭菌后糖液维持残糖在1.5～2.5之间。发酵80h可产异亮氨酸24.5g/L。第三节亮氨酸发酵L-亮氨酸（L-leucine，Leu）是Proust于1819年首先从奶酪中分离出来的，以后Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到其结晶，并定名为亮氨酸。L-亮氨酸是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之一，是临床选用的复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料。L-亮氨酸对维持危重病人的营养需要，抢救患者生命起着积极作用。L-亮氨酸可用于诊断和治疗小儿突发性高血糖症和作为头晕治疗及营养滋补类药物。L-亮氨酸还可用于合成具有抗癌、抗病毒、抑制细菌生长等生物活性的L-亮氨酸Schiff碱Cu（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）配合物。最新研究表明：由L-亮氨酸合成的多聚物，是临时创伤敷料的最佳原料之一，极具发展潜质。一、L-亮氨酸的生产方法L-亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、添加前体发酵法、直接发酵法等。1提取法L-亮氨酸在蛋白质中含量较多，将干酪素、角蛋白、血色素在酸性条件下水解，用碱中和即有亮氨酸沉淀，用β-萘矾酸使沉淀结晶，用离交法、层析法分离。国内虽有由天然蛋白质水解液分离提取L-亮氨酸产品，但该方法工艺费时、收率低，不适合大规模工业化生产。2化学合成法化学合成法又分Storeker法、α-卤代酸法等。前法是将异戊醛制成氰醇再制成氨基腈后水解，或将异戊醛先制成乙内酰尿衍生物后加压加热水解；后法是将异己酸在三氯化磷存在的情况下加入溴生成α-溴异己酸，再与氨作用生成亮氨酸。3发酵法发酵法是利用微生物菌体的生物合成作用，过量积累L-亮氨酸的过程。包括微生物转化法和微生物直接发酵法。1）微生物转化法又称添加前体发酵法。利用葡萄糖为发酵碳源、能源，再添加目的氨基酸的前体物，经特定微生物的代谢转化作用将该前体物有效地转化为目的氨基酸。德国学者UlrichGroeger采用分批流加培养法，流加生物合成L-亮氨酸的前体物α-酮基异己酸32g/L，经谷氨酸棒杆菌ATCC13032发酵23小时，产L-亮氨酸24g/L。2）微生物直接发酵法利用微生物能自身合成L-亮氨酸的能力，通过对出发菌株（通常用谷氨酸产生菌如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等）的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏，达到过量积累L-亮氨酸的目的。以微生物直接发酵法生产L-亮氨酸，在国外（如日本）已形成一定规模的工业生产能力。二、L-亮氨酸产生菌代谢控制育种策略及实例（一）L-亮氨酸的生物合成途径及代谢调节机制由图13-1可知，L-亮氨酸的生物合成途径从丙酮酸开始直至形成α-酮基异戊酸，与L-缬氨酸的相应合成途径完全相同。丙酮酸在乙酰羟基酸合成酶的催化下，与来源于丙酮酸的活性乙醛基缩合形成α-乙酰乳酸。活性乙醛基是乙醛基与α-羟乙基硫胺素焦磷酸结合的产物。α-乙酰乳酸在二羧酸还原异构酶催化下发生甲基自动位移形成α，β-二羟基异戊酸。该产物经二羧酸脱水酶催化脱水后形成L-缬氨酸相应酮酸—α-酮基异戊酸。α-酮基异戊酸在α-异丙基苹果酸合成酶的作用下，接受由乙酰CoA转来的酰基形成α-异丙基苹果酸。α-异丙基苹果酸在α-异丙基苹果酸异构酶作用下形成β-异丙基苹果酸，再经以NAD为辅助因子的β-异丙基苹果酸脱氢酶作用形成α-酮基异己酸。α-酮基异己酸由支链氨基酸转氨酶催化与谷氨酸转氨形成L-亮氨酸。L-亮氨酸生物合成的代谢调节机制如图13-2所示。丙酮酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物，α-酮基异戊酸是合成L-缬氨酸的直接前体物，又是合成L-亮氨酸间接前体物。催化丙酮酸生成α-酮基异戊酸的酶系，与催化α-酮基丁酸生成α-酮基-β-甲基戊酸的酶系是相同的，这些酶的合成均受到三种支链氨基酸的协同反馈阻遏。其中的乙酰羟基酸合成酶是由丙酮酸合成α-酮基异戊酸的关键（限速）酶，还受到L-缬氨酸的反馈抑制。在由α-酮基异戊酸合成L-亮氨酸过程中，α-异丙基苹果酸合成酶是关键（限速）酶，受到L-亮氨酸的反馈抑制和阻遏。乙酰羟基酸合成酶对α-酮基丁酸的亲和力比对丙酮酸的高。α-异丙基苹果酸合成酶对α-酮基异戊酸的亲和力比支链氨基酸转氨酶对α-酮基异戊酸的亲和力约高十倍。所以，三种支链氨基酸生物合成的优先顺序为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。据此可知，在α-酮基丁酸之前减弱或切断异亮氨酸的代谢流，对亮氨酸的优先合成有重要作用。大肠杆菌分支链氨基酸合成酶系的基因组成如图13-3所示。大肠杆菌细胞中由丙酮酸生成L-亮氨酸的酶系受到两个主要的操纵子（ilv操纵子和leu操纵子）的调控。ilv操纵子中的DACB基因编码合成三种支链氨基酸共用的3个多功能酶。从α-酮基异戊酸合成L-亮氨酸的酶系，是由leu操纵子中的DCBA基因编码的：基因Ａ编码α-异丙基苹果酸合成酶，基因Ｂ编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，基因Ｄ、Ｃ编码α-异丙基苹果酸异构酶。leuDCBA操纵子被靠近结构基因Ａ的调节区所控制。（二）L-亮氨酸育种策略1.出发菌株的选择目前棒杆菌属、短杆菌属的L-亮氨酸生物合成途径及其调节机制已弄清，以鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）、粘质赛氏杆菌（Serratiamarcescens）、乳糖发酵短杆菌（Brevibacteriumlactofermentum）、钝齿棒杆菌（Corynebacteriumcrenatum）、黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）为出发菌株，均有选育出L-亮氨酸高产菌的文献报道。2.解除反馈抑制与阻遏根据L-亮氨酸生物合成的代谢调节机制，要通过代谢控制育种手段获得L-亮氨酸高产菌，必须实现三个解除一个改变：①解除三种支链氨基酸对生物合成途径上的乙酰羟基酸合成酶等3个共用酶的协同反馈阻遏作用；②解除L-缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制作用；③解除L-亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制和阻遏作用。以上可通过使菌体带上L-亮氨酸和L-缬氨酸结构类似物抗性标记(如：2-TAr、α-ABr、β-HLr、Valr、LeuHxr等遗传标记)来实现。④改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累。这可通过使菌体带上某些药物类(如：SGr等遗传标记)或抗生素类抗性标记(如：Rifr等遗传标记)来实现。结构类似物（代谢拮抗物）的作用机理是：正常细胞合成代谢的最终产物对于有关酶的合成具有阻遏作用，对于合成途径的第一个酶具有反馈抑制作用。这是由于终产物能与阻遏蛋白或变构酶相结合的缘故。由于这种结合是可逆的，所以当代谢最终产物例如L-亮氨酸，参与代谢而在细胞内浓度降低时，它就不再与阻遏物以及变构酶相结合，这时有关酶的合成以及它们的催化作用便又可继续进行。代谢拮抗物由于与代谢产物结构相似，所以同样能与阻遏物以及变构酶相结合，可是它们往往不能代替正常的L-亮氨酸而参与蛋白质的合成，也就是说它们在细胞中的浓度不会降低，因此与阻遏物以及变构酶的结合是不可逆的。这使得有关的酶不可逆地停止了合成，或是酶的催化作用不可逆地被抑制。表现为菌株在添加有临界浓度以上的结构类似物的培养基中不能生长。2-噻唑丙氨酸（2-TA）是L-亮氨酸和L-缬氨酸的结构类似物，通过选育2-TAr抗性标记，有利于解除乙酰羟基酸合成酶和α-异丙基苹果酸合成酶所受到的反馈抑制和阻遏。α-氨基丁酸（α-AB）是缬氨酸的结构类似物，选育α-ABr有利于解除缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制。亮氨酸氧肟酸盐（LeuHx）和β-羟基亮氨酸（β-HL）是亮氨酸的结构类似物，选育LeuHxr和β-HLr等抗性标记，均有利于解除终产物亮氨酸对L-亮氨酸生物合成酶系所受到的反馈抑制和阻遏，从而大幅度地提高L-亮氨酸的产量。2-TAr和β-HLr这两个标记，对L-亮氨酸高产菌的育种非常重要。筛选磺胺胍抗性标记（SGr）菌株，在氨基酸产生菌选育上具有普遍提高产酸能力的作用，关于其详细机制，尚未见到令人信服的报道。一般认为，磺胺胍是细菌的生长因子——对氨基苯甲酸（PAPA）的结构类似物，而PAPA是叶酸的一个组分，不少细菌要求外界提供PAPA以合成其代谢中必不可少的辅酶—四氢叶酸，因而二者起竞争性拮抗作用。一旦菌株带有磺胺胍抗性标记，菌体的正常代谢发生改变，从而导致像氨基酸这样的代谢产物大量的积累。图13-5几种结构类似物的结构式筛选利福平抗性（Rifr）菌株有利于L-亮氨酸产量提高，其机制尚不清楚，可能是通过改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累。利福平为半合成广谱抗菌素，对革兰氏阳性和阴性细菌以及结核分支杆菌均有明显抗菌效应。抗菌机理是：通过与细菌RNA聚合酶的β亚基结合，抑制细菌RNA聚合酶的活性，妨碍细菌RNA转录的启始。但是RNA转录一旦开始，利福平则不起作用。人们还发现：结核分支杆菌耐利福平与细菌RNA聚合酶的β亚基编码基因rpoB的突变有关。rpoB基因全长3543个碱基，当其中有81个碱基的核心区域发生突变时，利福平不能与RNA聚合酶β亚基结合，导致细菌对利福平耐受。黄海荣等通过对rpoB基因588bp易变区进行DNA序列分析，报道了我国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变的特点：193株耐利福平临床分离株中有172株存在rpoB基因核心区域的点突变，突变率为89.1%（172/193）；46株利福平敏感株均未检测到核心区域的突变。突变类型包括39种，涉及了24个碱基，15种氨基酸。有86个耐利福平菌株的点突变位于11223位碱基，发生了从胞嘧啶向胸腺嘧啶的转换，使531位丝氨酸转换为亮氨酸，占所有菌株的44.6%(86/193)。另一个比较常见的发生突变的氨基酸是位于526位的组氨酸，其突变率是17.1%(33/193)，其相应密码子CAC的三个碱基都可能发生突变，其中最常见的是第一个胞嘧啶，可转换为腺嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶（分别是2/33，9/33，10/33）。531位和526位氨基酸突变率之和是62.3%，在我国结核分支杆菌与耐利福平有关的突变中最为常见。在研究中未发现有缺失或插入类型的突变，说明在我国结核分支杆菌产生耐利福平的主要形式是点突变。利福平的化学结构式为：筛选L-异亮氨酸缺陷型的回复突变株也可望提高L-亮氨酸产量。因为L-亮氨酸生物合成的关键酶α-异丙基苹果酸合成酶的底物专一性宽，也能以丙酮酸为底物，催化丙酮酸生成α-甲基苹果酸，该酶受L-亮氨酸的反馈抑制。α-甲基苹果酸可在解除阻遏的L-亮氨酸生物合成酶系催化下，经过几步酶促反应生成α-酮基丁酸。因此，解除了L-亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶反馈抑制的突变株，可利用该酶底物专一性宽(特异性不强)的特性，从丙酮酸生成α-酮基丁酸，α-酮基丁酸通过异亮氨酸、缬氨酸酶系转变成L-异亮氨酸，表现为L-异亮氨酸缺陷型的回复突变。在L-异亮氨酸缺陷型的回复突变株中，可能混有L-苏氨酸脱氨酶的回复突变和α-异丙基苹果酸合成酶对反馈抑制脱敏的两种类型突变株，可通过亮氨酸缺陷型的生长谱法加以认别。3.减弱或切断支路代谢，并增加前体物的合成基于丙酮酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物，α-酮基异戊酸是L-缬氨酸的直接前体物，又是合成L-亮氨酸的间接前体物，因此，在增大丙酮酸合成代谢流的同时，应使α-酮基异戊酸主要流向L-亮氨酸。从图13-1的代谢途径可知，欲切断α-酮基异戊酸合成L-缬氨酸这一代谢支路来选育L-亮氨酸高产菌是行不通的。因为催化合成三种支链氨基酸的转氨酶是同一个酶。因此，从选育营养缺陷突变株的角度看，只能通过选育异亮氨酸缺陷突变株来解除3个共用酶受所到的反馈阻遏。在亮氨酸反馈调节脱敏的L-亮氨酸高产菌中，该酶能优先利用α-酮基异戊酸来大量合成L-亮氨酸，但当菌体自身合成缬氨酸的量或培养基中添加的缬氨酸的量偏低，L-亮氨酸高产菌很容易发生回复突变，表现为产酸不稳定和产率下降。选育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱、天冬氨酸族氨基酸缺陷等突变株，可增大L-亮氨酸生物合成代谢流，节约碳源，从而有利于L-亮氨酸产量的提高。选育以琥珀酸为唯一碳源生长微弱的突变株，即可获得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱的突变株。在乳糖发酵短杆菌中，亮氨酸的生物合成与赖氨酸之间还存在着代谢互锁，赖氨酸生物合成分支途径的第一个酶（二氢吡啶-2，6-二羧酸合成酶，DDP合成酶）的合成受亮氨酸阻遏。因此，L-亮氨酸的大量积累会引起赖氨酸生物合成途径上的DDP合成酶的合成受到阻遏，从而使丙酮酸通向赖氨酸的代谢受阻。另外，有研究报道，L-亮氨酸生物合成的限速酶α-异丙基苹果酸合成酶，在1mmol/L亮氨酸存在下80%受抑制，而添加1mmol/L赖氨酸之后，即可恢复，而且赖氨酸可促进该酶的活性。4.切断进一步代谢途径要大量积累L-亮氨酸，需切断或减弱亮氨酸进一步向下代谢的途径，使合成的亮氨酸不再被消耗，如选育以L-亮氨酸为唯一碳源不能生长或生长微弱的突变株。5.利用基因工程技术构建L-亮氨酸工程菌基因工程技术主要通过目的基因扩增，增加生物合成途径中的限速酶，以提高目的产物的产量。从L-亮氨酸生物合成途径及代谢调节机制可知，α-异丙基苹果酸合成酶是L-亮氨酸生物合成途径中真正意义上的限速酶，将编码该酶的基因克隆到L-亮氨酸产生菌中，增加该酶的数量，以解除其“瓶颈”的限速作用，从而提高L-亮氨酸的产量。综合以上分析，可以推理出L-亮氨酸高产菌可以带有的遗传标记为天冬氨酸族氨基酸缺陷，如：蛋氨酸缺陷（Met-）、异亮氨酸缺陷（Ile-）等；脯氨酸或丙氨酸缺陷（Ala-）；结构类似物抗性，如：2-噻唑丙氨酸抗性（2-TAr）、α-氨基丁酸抗性(α-ABr)、β-羟基亮氨酸抗性（β-HLr）、亮氨酸氧肟酸盐抗性（LeuHxr）或缬氨酸抗性（Valr）、磺胺胍抗性(SGr)和利福平抗性(Rifr)等。L-亮氨酸高产菌的整体育种策略如图13-6所示。图13-6L-亮氨酸高产菌育种策略图（三）L-亮氨酸产生菌的育种实例Kisumi等由粘质赛氏杆菌异亮氨酸缺陷型菌株选育α-氨基丁酸（α-AB）抗性时，意外获得异亮氨酸缺陷的回复突变株，在10%的蔗糖培养基中可发酵积累L-亮氨酸10~13.5g/L。Tsuchida等将乳糖发酵短杆菌2256进行诱变，获得具有2-噻唑丙氨酸抗性（2-TAr）兼蛋氨酸和异亮氨酸双重缺陷(Met-+Ile-)突变株No.218，在13%的葡萄糖培养基中可积累L-亮氨酸28g/L。证明了该菌株已解除了L-亮氨酸对其生物合成的第一个酶—α-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制和阻遏。Akashi等研究了通风等条件对产酸率的影响，在最佳条件下该菌株产酸率可达30g/L。张素鑫等由钝齿棒杆菌AS1.542经NTG连续诱变处理，选育得到一株L-亮氨酸产生菌AS1.1004，可产14g/L的L-亮氨酸。张素珍等继续以AS1.1004为出发菌株，经NTG和快中子处理后获得变异株L-421（L-异亮氨酸缺陷、2-噻唑丙氨酸抗性，Ile-+2-TAr），在2000L发酵罐上，于30℃发酵40h，可产L-亮氨酸20g/L。宫锦芗将黄色短杆菌T6-13经多次诱变处理，并结合氨基酸结构类似物的筛选，最终获得一株具有苏氨酸缺陷、2-噻唑丙氨酸抗性、β-羟基亮氨酸抗性及缬氨酸抗性(Thr-+2-TAr+β-HLr+Valr)的L-亮氨酸产生菌920-36，在最佳条件下，该菌株可在发酵液中积累13.5g/L的L-亮氨酸。Tsuchida等还采用亚硝基胍（NTG）诱变等方法处理乳糖发酵短杆菌2256，最终选出一株L-亮氨酸高产菌（34号菌,Ile-+2-TAr+β-HLr），可在13%葡萄糖培养基中积累L-亮氨酸34g/L。李彤等从钝齿棒杆菌中分离获得一株能稳定高产L-亮氨酸的菌株B20-1，其遗传标记为Pro-+2-TAr+N-Leur+N-Valr+LeuHxr+DL-N-LeuHxr，产酸可达15g/L。刘党生等采用紫外线诱变处理天津短杆菌T6-13，选育得到一株L-亮氨酸产生菌No.145，其遗传标记为AHVr+Rifr，可产21.8g/L的L-亮氨酸。齐秀兰等分别以黄色短杆菌T6-13、黄色短杆菌CF-435为出发菌，利用紫外线、氯化锂对其原生体进行复合诱变，选育得到两株L-亮氨酸产生菌57-4S、UV3-29，其遗传标记为Rifr，可产23.45g/L、26.73g/L的L-亮氨酸。伍时华等利用原生质体融合技术定向选育的黄色短杆菌TQ9806（Met-+2-TAr+α-ABr+β-HLr+SGr），可产22.7g/L的L-亮氨酸。陈宁等以黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）HL41（CICC10135）为出发菌种,通过硫酸二乙酯（DES）和紫外线诱变处理，经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代，筛选出一株L-亮氨酸生产菌株TK0303（Met-+IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr+Rifr+SGr），该菌株发酵60h可产L-亮氨酸36g/L。三、L-亮氨酸的发酵过程控制以天津科技大学陈宁等选育的L-亮氨酸产生菌黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）TK0303（Met-+IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr+Rifr+SGr）为例，介绍发酵法生产L-亮氨酸的工艺。吸取无菌水于10支试管（18×180）生长良好的活化斜面试管中，将所有菌悬液全部接入5L种子罐中的1500ml种子培养基[种子培养基成分（g/L）：无水葡萄糖37，豆饼水解液25mL，尿素2(分消后补加)，KH2PO4·3H2O1.3，MgSO4·7H2O0.4，MnSO4·H2O0.01，L-Met0.4，VB1300μg，VH200μg，pH7.0~7.20.075MPa20min]，搅拌转速300~500r/min，维持溶氧在20%左右，通过自动流加氨水和稀盐酸控制pH在7.0，培养温度28℃，培养至对数生长中后期，约26h转发酵，此时，菌体净增浓度△OD620nm在0.6以上。按10%的接种量将种子液600mL接入装有5.4L发酵培养基的10L发酵罐中；发酵培养基成分为（g/L）：无水葡萄糖80，玉米浆46mL，(NH4)2SO420，NH4Ac12，KH2PO4·3H2O1.3，MgSO4·7H2O0.5，MnSO4·H2O0.01,L-Met0.7，L-Ile0.060，L-Glu0.40，V