鸭梨芽变新品种(Hc)抗黑星病及主要品种特性研究

ThepearscabresistanceandcharacteristiesofPy,'usbretschneideriRehd．ev．Yali(tlc)Postgraduate：ZhiTingSpeciality：ForestprotectionSupervisor．AssociateProf．CuiJian-zhouProf．DuKe-jiuProf．LiuChun-qinAbstractPl，九姆bretschneideriRehd．CV．ⅥllioriginatedinhebeiiSallaneientspecieswinlexcellentandhi曲yieldcharacteristics．Ithasthehighadaptability,butitsdiseaseconsistanceislow．Thepearscab(VenturianashicolaT{makaetYamamoto)isoneofmaindiseasesonⅧipears，andithasbeenspreadingalmostalltheY．alipearproductionareasinCIlina．Inrecentyears．pearscabhasbeenmoreseriousyearafteryearandithasbeenbecomethemainrestrictivefactoraffectingthepearproduction．Selectingnewvarietieswiththedisease-resistanceandkeepingallexcellentqualitieshavebeenthemosteconomicalandthemosteffectiveandthesecurestmethodsoncontrollingthedisease．TheculturehistoryofⅧipearhasseveralthousandyears．Inthelong-termcultivationprocess，itwillspontaneouslyproducencwmutanttype．砌ipearHeisaYalipearsprout．111eresultsofseveralyearsinvestigationsshowedbothYmipearHeanditsgraftingtreeswerehighresistanttopearscabinfield．111ediseasereactiontypeofY甜ipearHctoVenturianashicolaanditsleavesstructureandphysiologicandbiochemicalindexandmolecularbiologyandthetissueculturewerestudiedinthepaper．nemainresultsareasfollows：1．IIlthisPaper,severaldifferenthormonesandvitaminswereusedtoresearchthegrowthoftheVenturianashicolainvitro．Resultsshowedthata-NAA、2．4一D、l(T、vitaminB!andvitaminCincreasedVenturianashicolamyceliumgrowth．Theeffectofa-NAAonpromotingVenturianashicolamyceliumgrowthwasobviously．111econcentrationof10mg／Lofu-NAAwasthebestusingconcentration．2．ThesproutsofdormantbutafterhydroponiceulutreandoftreesinMaywereusedasexplantsfortheestablismentoftheregenerationsyetem．ThebestexplantWasthesproutsfromthefieldYalipearHcofmid-may．theoptimuminductionmediumwas1／2MS+6一BAO．2rag／L+IBAO．ameer,．3．ResistanceidentificationofYalipearHctoVenturianashicolawascarriedoutinfieldwhenpearscabhappening．111eresultsshowedthattheresistancetopearscabbetweenYalipearHcandYalipearhadsignificantlydifferences．YalipearHcshowedllighresistancetopearscabandYalipearWaslowresistance．4．Thereweredifferentleavesstructurebet-wg宅=nresistantcultivarY甜ipearHcandYalipearatdifferent1eafstages．TheleavesstructurewerestudiedincludedthicknessofL■■y—l‘17L■■，leaves，palisadetissue,spongyparenchyma,upperepidermalcellandoflowerepidermalcell，celltenseratioandspongyratio，contentofwax，densityofstomata,andthecomparisonofleafspecificdensity．TheresultshowedthattheresistantcultivarY酊ipearHcleaveshadhighwaxcontent．10wstomatadensity,thickpalisadetissueandthepalisadetissuearrangedclose．ThoseleafstructurecharactersofY矾ipearHcwascorrelatedwiththeresistancetoVenturianashicola．Buttheleafspecificdensitywasnotcorrelatedwithit．5．Thecontentofhealthfulleaveschlorophyll．totalsolublesugarandtotalsolubleproteinbetweenresistantcultivarⅧipearHcandY甜ipearwerecomparedunderconditionofuninfectionatdifferentleafstages．TheresultsindicatedthatthecontentofchlorophyllandtotalsolubleproteinintheleavesofhealthfulresistantcultivarYalipearHcweresignificantlyhigherthanthoseinYalipear’butthecontentoftotalsolublesugarinitwaslowerthanthatinⅧipeaL6．neorthogonaldesignWasusedtooptimizeISSR-PCRamplificationsystemofPyrusbretschneideriRehd．cv．YaliHcinfourfactors(DNAtemplate，primer,dNTPs，andTaqDNApolymerase)atfivelevelsrespectively．TheresultsofPCRwasanalyzedbysoftwareDPS7．55．andthebestlevelofeachfactorwereselected．ThemostsuitableISSR-PCRreactionsystemWas1xTaqPCRBuff砒1．5retool‘L．1M旷’。】，60rigDNAtemplate，0．4pmol·L-1prim％0．1mmol·L-‘dNTPs，2．0UTaqDNApolymerasein20pLreactionsystem．7．Inter-simplesoquenerepeat-polymerasechainreactionwasusedtoevaluateforitspotentialuseintheidentificationofY出ipearHc．10ISSRprimersselectedfromtotal100ISSRprimerswel"oapplied、加t11ISSRanalysistostudythegeneticsubstancedifferencesbetweenY址ipearHcandY酊ipearand10oftheISSRprimers(UBC807，UBC808，UBC810，UBC828，UBC829，UBC835，UBC841，UBC842，UBC850，UBC851)werefoundtoproducestablepolymorphicfragments．TheISSR-PCRassayrevealedtotalnumberof58DNAbands，whichofonlylbandwaspolymorphic(thepercentageofpolymorphicbands，PPB=I．72％)．Y枷pearHcandYalipearcouldbedistinguishedclearlywithprimerUBC810．Y酊iPearHccouldproduceapieceofDNA400bpinlength．butYalipearhadnoone．8．Thespecificfragmentsof嘲ipearHcWasclonedandsequencedbyusingtheprimerUBC810．Sixdifferentsequenceswereobtained．whichofthre∞werehomologouswiththepublishedESTsofseedlingleavesinfectedbyVenturiainaequalis，seeds，flowersandfruits．theotherthreewerenew．nosefunctionsarebeingidentified．Keywords：YalipearHe；VenturianashicolaTanakaetYamarnoto；Structureresistance；ISSR；VarietyidentificatiomESTsJ●●■■—1，i●J■■■■，、目录第一章引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l梨黑星病研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1梨黑星病症状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．2梨黑星病病原菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．3梨黑星病发病规律⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．4梨抗黑星病抗病机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．5梨抗黑星病的抗性遗传⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42植物形态结构与抗病性的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43果树芽变DNA分子标记鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53．1随机扩增多态性DNA(RAPD)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．63．2扩增片段长度多态性(AFLP)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63．3ISSR分子标记技术0SSR)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯73．4基于逆转座子的分子标记⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯74研究目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8第二章梨黑星菌离体培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。9l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．91．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92结果与⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．102．1不同激素、维生素对梨黑星菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．2不同浓度a．萘乙酸对梨黑星菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。103结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12第三章鸭梨He组织培养研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．13l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l31．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。131．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一l32．1不同来源及不同取样时间对芽诱导分化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。142．2不同6_BA浓度对新生芽增殖的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。142．3不同外源激素对嫩茎诱导生根的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．153结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。16第四章鸭梨He抗黑星病抗性鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。171材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l71．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．171．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。172结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．183结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18第五章鸭梨Hc叶片结构、生化物质含量研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯201．1供试材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯201．2供试方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．202结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．1鸭梨Hc与普通鸭梨不同成熟度叶片显微组织结构比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．2鸭梨Hc与普通鸭梨不同成熟度叶片气孔形态比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．3鸭梨Hc与普通鸭梨不同成熟度叶片蜡质含量、叶比重比较⋯⋯⋯⋯．．252．4鸭梨Hc与普通鸭梨不同成熟度叶片叶绿素含量变化情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．5鸭梨Hc与普通鸭梨不同成熟度叶片可溶性总糖含量变化情况⋯⋯⋯．．262．6鸭梨Hc与普通鸭梨不同成熟度叶片可溶性蛋白含量变化情况⋯⋯⋯～273结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．273．1鸭梨Hc叶片形态结构与抗黑星病的相关性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．2鸭梨Hc叶片生化物质含量与抗黑星病的相关性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28第六章鸭梨HcISSR品种鉴定分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯291材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．291．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一291．2基因组DNA的提取与检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯301．3鸭梨HcISSR反应体系的建立与优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。301．4鸭梨HcISSR引物筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l1．5鸭梨HcISSR特异片段的回收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．321．6特异片段与载体的连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．321．7DNA转化感受态细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．321．8重组质粒的筛选及鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．331．9特异片段DNA序列测定和序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．1鸭梨HcISSR最佳反应体系的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．332．2引物的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．372．3鸭梨Hc芽变鉴定ISSR扩增结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯372．4鸭梨Hc特异片段的回收、克隆与测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．392．5特异片段的测序结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．393结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．403．1正交优化鸭梨HcISSR．PCR反应体系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯403．2鸭梨HcISSR品种鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。4l全文结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．42参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一43在读期间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．49作者简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。50j}C谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l鸭梨芽变新品种(Hc)抗黑星病及主要品种特性研究第一章引言弟早jI苗梨是中国三大水果之一，我国作为梨的原产地，为东方梨主要生产斟¨。据联合国粮农组织(AFO)统计数据，2009年中国梨总产量达到1300万t，约占世界总产量的60％。我国栽培梨的历史悠久，距今至少4000年以上【2】。鸭梨属白梨系统，原产于河北，是我国栽培历史最久的优良品种。鸭梨以其风土适应性强，早果丰产，品质优良等特点而被重视。目前，鸭梨广泛栽培于河北、山东、辽宁、山西、江苏、安徽、河南、陕西、北京、天津、浙江、宁夏等省地，其中，以河北最为著名。河北又以泊头、魏县、晋州三地的鸭梨最为著名。古代梨果被尊为“百果之宗"，果实不仅营养丰富而且具有药用价值。每l009鲜果果肉中含蛋白质O．19，脂肪0．19，碳水化合物129，钙5mg，磷6mg，铁0．2mg，胡萝卜素、硫胺素、核黄素各0．01mg，尼克酸0．2mg，以及各种维生素如：维生素C、维生素A、维生素B和维生素P等多种营养物质【3】。据古农书和古药典记载，梨果生食可祛热消毒、生津解渴、帮助消化，熟食具有化痰润肺、止咳平喘之功效。现代医学实践，长期食用梨果具有降低血压、软化血管的效果14J。梨树病害一直是制约梨产业发展的主要因子之一。梨树病害不仅增加了梨生产技术的难度，加大了梨生产的成本，而且还影响梨树的寿命，限制梨生产区域的扩大，更为严重的是降低了梨果实品质和产量[51。我国梨树病害大约有80多种，其中发生最普遍、危害最严重的首推梨黑星病。梨黑星病又称疮痂病、雾病，是鸭梨的主要病害，常造成生产上的重大经济损失，每年给果农造成直接和间接损失高达30％【6J。我国各个梨产区均有发生。梨黑星病发生严重时，常造成新梢枯死，引起幼叶、幼果脱落，病果遍布黑斑、畸形龟裂，不堪食用，直接影响果品产量和质量。在病害流行年份，病叶率达90％，病果率达50‰70％，严重影响梨的优质高产17J。l梨黑星病研究进展1．1梨黑星病症状梨黑星病能侵染梨树所有绿色幼嫩组织。主要侵害叶片和果实，也可以为害花序、芽鳞、新梢、叶柄、果柄等部位，从落花期到果实成熟期均可为害。病斑初期变黄，后变褐枯死，并长黑绿色霉状物，为该病的主要特征【2J。幼叶感病性较强，在发病初期，先在叶背面的主脉两侧和支脉之间产生黑绿色至黑色霉状物，尤其叶脉上最多，不久在霉状物对应的叶正面出现圆形、椭圆形或不规则淡黄色病斑，严重时叶片枯黄造成早期落叶。叶脉和叶柄受害时出现黑色、长条形中部凹陷病斑。生长期新梢受害，多在徒长枝或秋梢幼嫩组织上形成病斑，病斑椭圆形或近圆形，淡黄色，微隆起，表面有黑色霉层，以后病部凹陷、龟裂，呈疮痂状。河北农业大学硕士学位(毕业)论文果实受害初期，果面产生淡黄色小病斑，条件适合时病斑逐渐扩大、表面长满黑霉；条件不适合时，病斑上不长出黑霉，呈绿色斑。幼果受害后其生长受阻，病果呈现畸形、开裂，病部果肉变硬，具苦味，果实易提早脱落。果实成长期受害，果面出现大小不等的圆形或近圆形黑色病斑，表面木栓化、粗糙，霉层很少，果实不畸形。果实采收前受害，果面会出现淡黄色小病斑，边缘不整齐、多呈芒状，无霉层，但采收后如经短期高温高湿，则病斑扩展很快，并长出大量黑色霉层。1．2梨黑星病病原菌梨黑星菌包括两个亚种，一个是Venturiapirina(cook)Aderhold，另一个是VenturianashicolaTanakaetYamarnoto。我国梨黑星病的病原菌为：有性态为纳雪黑星菌[VenturianashicolaTanakaetYamamoto]，子囊菌f7(Ascomycotina)黑星菌属(VenturiadeNot．)；无性态为梨黑星孢[Fusiclasiumpirinum(Lib)Fuekel]，半知菌亚门(DeIlt啪mycotina)黑星孢属(F髑icl弱i啪)俐。最初梨黑星菌的定名依据其无性世代为Fusiclasiumpirinum(Lib)Fuekel。后来Aderhold发现侵染欧洲梨的黑星茵有性世代，并根据其有性世代子囊、子囊孢子等特征定名为VenturiapiHna(cook)Aderhold。但田中彰一等发现侵染日本梨的黑星茵在形态特征和致病性方面与Venturiapirina(cook)Aderhold存在显著差异，这些差异已超出种内差异，故将其定名为VenturianashicolaTanakaetYamamoto。在形态上lshii【91认为，Venturiapirina的子囊孢子比Venturianashicola长且宽；分生孢子比Venturianashicola明显长。在致病性上Venturianashicola只侵染日本梨和中国梨，不侵染西洋梨，而VenturiapiHna与前者相反。梨黑星菌存在致病性生理分化，有不同的生理小种。Shabioo]发现以西洋梨为寄主的Venturiapirina有4个生理小种。Chevalier等⋯J也证实Venturiapirina存在生理小种。Ishii等将侵染日本梨的梨黑星菌Venturianashicola分为3个生理小种。范燕萍等【12】通过对不同地区不同梨品种上的梨黑星菌进行接种致病力测定，认为我国梨黑星菌存在生理分化，并将其分为4个类型，分别为：类型I(浙江八云梨、万县苍溪梨)、类型H(雅安鸭梨、辽宁兴城鸭梨)、类型III(安徽早酥梨)、类型Ⅳ(河北鸭梨_)。而沈言章等【13】将梨黑星菌(Venturianashicola)初步划分为5个不同的致病类型。分别是：致病I型(上海菊水、上海八云、杭州菊水、八云A、八云B)、致病II型(河北鸭梨)、致病IIl型(台湾水梨)、致病Ⅳ型(四川丰水梨、幸水梨、鸭梨、苍梨)、致病V型(雅安鸭梨)。汤浩茹等【14悃生物间遗传学的原理和方法将中国梨黑星菌划分为5．6个致病类型。1．3梨黑星病发病规律梨黑星菌能以分生孢子、菌丝体和子囊壳三种形式越冬。以分生孢子、菌丝体在芽内越冬时，次年春随梨树萌芽形成的病芽梢，成为初侵染源；以未成熟的子囊2鸭梨芽变新品种(Hc)抗黑星病及主要品种特性研究壳在落叶内越冬时，于次年梨树萌芽后逐渐释放子囊孢子，成为侵染源[J5】。梨黑星病菌虽能以多种形式越冬，但在不同地区、不同年份，其越冬的主要形式各不相同。在冬季潮湿偏暖的地区，有性世代的子囊壳是其越冬的主要形式。在冬季干燥寒冷的北方地区，分生孢子可能是其越冬的重要形式。在芽组织内越冬后菌丝体所形成的病芽梢则可能是我国北方地区常年条件下的主要初侵染来源。越冬方式的不同，造成病菌在树体上的发病部位有差异。在芽内越冬的，在新梢基部先发病；在落叶上越冬的，则先在树冠下部叶片上发病。目前对梨黑星菌侵染寄主过程的研究报道较少，李保华等【l¨7】采用组织透明及扫描电镜研究了梨黑星菌分生孢子侵入过程、寄生部位及致病作用。研究发现：梨黑星菌分生孢子可直接穿透角质层，且从气孔保卫细胞外缘侵入率较高。梨黑星菌不寄生叶肉细胞，但能导致叶肉细胞病变。病原菌并非只在角质层与表皮细胞间生长，而且在表皮细胞和叶脉薄壁组织细胞的细胞间寄生。梨黑星病的发生与气候条件、梨类群和品种的抗病性有关。降水是影响病害发展的重要条件fl引。梨黑星菌的分生孢子和子囊孢子主要通过雨水传播。据研究降雨能促进黑星菌产孢，病菌孢子侵染有1次5mm以上的降雨，特别是连续48h以上的阴雨，因此，5．7月份多雨容易导致黑星病大流行。赵宗方等【l卅研究梨黑星病在长江中下游梨区为害，认为梨黑星病5月中旬的前期为害程度与上年7月的降雨量呈极显著的正相关，与8月的降雨量呈显著相关，病害流行最适温度为18．25℃的温度，30℃以上停止发病【20】。Li等【2l】对梨黑星病菌的研究表明，梨黑星病菌分生孢子最适生长温度是2l℃、最适相对湿度为97％。不同梨品种对黑星病抗病性差异显著。Vondracek【碉认为亚洲梨对梨黑星菌[Venturiapirina(cook)Aderhold]免疫。Postman等田】对不同梨品种、梨品系进行抗梨黑星病[Venturiapirina(cook)Aderhold]试验，结果表明亚洲梨抗病，94．1％的西洋梨不同程度感病，8个杂交品种的感病程度介于亚洲梨和西洋梨之间，有14个杂交品系果实上没有黑星病发生。我国为Venturianashicola的主分布区【24J。沈言章等125J通过接种试验和田间自然发病调查研究，结果显示，不同梨品种对梨黑星病的抗病性存在明显差异。一般以西洋梨较抗病，日本梨次之，中国梨最感病。在中国梨中，白梨系统感病重，其次为秋子梨系统，而砂梨、褐梨、夏梨较抗病。早酥、锦丰、香水、蜜梨和所有西洋梨抗病性较强；砀山酥梨、莱阳茌梨和雪花梨次之；最易感病的有鸭梨、京白梨、秋白梨、花盖梨等【261。引起梨品种间抗病性差异究其原因主要是因为病原菌存在不同生理小种分化。1．4梨抗黑星病抗病机制目前，梨树对梨黑星病的抗性机制尚不清楚，但已有不少学者对此进行了多方面的研究。活性氧代谢与梨抗黑星病的关系。在抗性品种中超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的含量高于非抗性3河北农业大学硕士学位(毕业)论文品种【241。酚类代谢与梨抗黑星病的关系。宋轶等【27】通过叶片接种，分期测定品种的总酚发现，品种的抗性与其体内固有含酚量无关，而与病菌侵入体内后总酚含量的增加，尤其是OD酚含量的增加明显相关。接种后，抗感病品种含酚量均增加，但抗病品种的OD酚含量比感病品种增加更显著。罗文华等【28】指出，抗病品种能抑制其叶片上梨黑星菌分生孢子的萌发及附着胞的形成。接种后，抗病品种的OD酚含量显著增加，而感病品种变化不明显。果胶酶和角质酶与梨抗黑星病的关系。亚角质层菌丝能够分泌果胶酶和角质酶。Muller[29]等研究认为Venturianashicola中角质酶的活性在Venturianashicola侵染过程中起着非常重要的作用。但Parkl30l等认为角质酶与梨品种的抗性无关，因为无论是抗性、易感还是非寄主材料的角质层，Venturianashicola都能侵入，并且完成附着胞和亚角质层菌丝的形成等一系列侵染的初级过程。果胶酶在侵染过程中也很重要，如果果胶酶的活性受到PGIP(多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)的抑制，真菌的侵染就会受到抑制。Faize等【31】通过对感病品种、抗病品种和非寄主品种接种梨黑星病菌(Venturianashicola)，发现抗病品种和非寄主品种的PGIP基因及其编码蛋白活性迅速升高；另外，从抗性品种中提取的PGIP能部分的抑制多聚半乳糖醛酸酶的活性，从而抑制黑星病菌的生长。1．5梨抗黑星病的抗性遗传国内外学者研究梨黑星病的抗性遗传，研究结果存在较大差异。早在1949年Crane等【32]认为欧洲梨品种对黑星病的抗性受多基因支配。但蒲富慎等【33】指出，日本梨对黑星病的抗性受单基因支配，但汤浩茹等【蚓以中国梨为试材认为梨黑星病的抗性可能由4对基因控制。目前人们普遍接受的是梨品种对黑星病的抗性受多基因控制，至于抗性是由不同的基因控制，还是由微效多基因控制，至今尚无定论，我们倾向于认为梨品种对黑星病的抗性是由不同基因控制的。许多学者研究认为梨对黑星病的抗性呈显性遗传，通过品种间杂交可获得抗黑星病的类型。梨杂交后代对黑星病的抗性受亲本品种的影响，以西洋梨作杂交亲本，后代中绝大多数不感染黑星病。2植物形态结构与抗病性的关系植物生存于自然界这个开放体系，在其生长和发育的过程中常会受到一些病原物的危害，导致植物生病死亡。植物病害实质是病原物与寄主之间相互作用的结果。植物与病原物在长期的相互作用、相互适应、协同进化的过程中，逐渐获得了一系列复杂的防御病原物侵染的能力，即抗病性【351。形态结构抗病性【361主要是通过寄主形态结构的差异产生物理上的阻碍，或通过诱导寄主形态结构发生改变而机械地阻碍病原物的侵染。4鸭梨芽变新品种(Hc)抗黑星病及主要品种特性研究植物对病原茵最初防御的场所在植物表面。病原菌与植物接触之前，植物表面已存在一些防御结构，如蜡质层厚、具有毛或刺、角质层厚、表皮细胞的结构紧密、气孔、水孔、皮孔的形态和厚壁细胞的存在等都可阻挡病原菌的侵入。病原菌要想侵入寄主首先必须能粘附在寄主表面，并萌发产生芽管，完成这一步常常需要寄主具备一个湿润的表面。早在1931年，Johnstone等p7】发现某些苹果品种的叶片和果实上具蜡质层，能迅速排除水滴从而抵抗苹果黑星病菌的侵染。植物表面的茸毛和刺，可以悬空病原菌从而减少其接触、侵入的机会【3引。有些植物的茸毛还可以产生有毒物质抑制病原菌孢子侵入和萌发。杨振民等【39】发现来自植物毛的某些物质可以抑制某些真菌的生长。水孔、气孔的密度、构造及运动也与抗病性相关。许多病原菌只能通过气孔才能侵入寄主，气孔密度和大小，则直接影响病原菌侵染的成功率；植物蒸腾速率可影响植物叶面湿度，对病菌孢子的萌发和侵入有间接影响。病原菌直接穿透寄主组织时，角质层可以阻止病原菌的侵入，起到增强抗病性的作用【删¨。表皮细胞壁的厚度和硬度也是重要的抗病因子。李淼等【42】研究发现猕猴桃抗溃疡病的抗病性与叶片厚度、表皮厚度呈正相关。姜淑苓等【43】对抗梨黑星病早金香梨叶片组织结构研究，发现其叶片的栅栏组织较厚，海绵组织致密，推断这些特征决定了黑星病菌分生孢子不易侵入叶片内部，起到了抵抗黑星病菌的作用。当病原菌侵入寄主植物后，会引起植物代谢变化产生主动防御结构，如形成木栓层、离层、侵填体和胶质。木栓层可抑制病原菌的扩展和毒素物质的扩散，阻止健康部分的营养物质和水分向感病部位流动。形成离层可抛弃感病部位，保护剩余健康组织。而侵填体在寄主感病部位大量快速形成，可以防止病原菌的继续扩展。植物胶在感病部位细胞的周围或细胞间隙迅速沉积，形成屏障阻碍病原菌贯穿，使病原菌饥饿死亡。3果树芽变DNA分子标记鉴定果树芽变是果树在生长过程中，芽的分生组织细胞自然发生遗传物质的突变mJ。它主要包括染色体数目变异、染色体结构变异、核内基因突变及核外基因突变四种类型【451。芽变往往是通过变异芽萌发成枝条，乃至开花结果以后，在外观上表现出与原类型明显不同时，才能被发现。因此，大多数芽变通常以“枝变"形式出现。若变异的枝芽未发现前，已无意识地用于无性繁殖，长成新的植株，将这种变异植株称为株变。果树是遗传学高度杂合的多年生木本植物，其芽变频率较高，芽变类型多样，既有花、果、枝等植株形态方面的变异，也有果实成熟期、果实品质、抗性等生理特性方面的变异。这些变异性状可以直接通过无性繁殖加以固定、繁殖和利用。因此，芽变选种在果树育种中，占有十分重要的地位。目前，应用于果树芽变鉴定的方法主要有形态学观察、同工酶分析、染色体倍性、数量与结构变异检测、DNA分子标记。果树芽变的实质是遗传物质的变异，5河北农业大学硕士学位(毕业)论文因此基于染色体与DNA分子水平的方法可避免形态性状描述的缺陷，达到早期鉴定和研究的目的。DNA分子标记技术是通过对品种DNA碱基序列的差异进行分析，鉴定不同品种。检测的对象为品种的DNA片段，可检测出单基因的变异，具有较高的准确性、稳定性和重复性。在果树芽变品种鉴别上较为常用、有效的分子标记有RAPD，AFLP，ISSR和基于反转录转座子的标记。3．1随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA)是由William和Welsh等(1990)建立起来的一种DNA分子标记技术，具有简单、快速和试验费用较低，不需预知研究对象的基因组序列等特点。现已在多种果树芽变鉴定上得到广泛应用。Striem以RAPD技术成功地鉴别了葡萄芽变品种及其母株M。Pooler等【47J用RAPD技术在桃的同株树上发现了二倍体和与其芽变的RAPD带型的差异。李汝刚【48】应用RAPD在苹果上成功地进行了芽变鉴定。王西平掣49】通过RAPD分析获得与葡萄早熟性状相关的三条多态性DNA片段。肖璇、王心燕等[s0-s1]用RAPD技术鉴别出‘石硖’龙眼芽变系及其母树。宁允叶152】从300条RAPD引物中筛选出10条多态性引物对猕猴桃全红芽变系‘86-3’进行分析，得到全红芽变系嫁接株的果肉颜色早期预测的RAPD标记。刘遵割53】对金花梨及其12个变异系进行RAPD分析发现5个引物能在品种与突变体间扩增出多态性片段。刘迪m】成功的利用RAPD技术鉴别苹果梨变异单系。马兵钢【55】通过RAPD对梨属植物进行品种鉴定，采用引物OPDl6可用于区分供试材料中的3个芽变品种。RAPD引物是随机设计的，从理论上讲，任何点突变都具有被检测的可能性。但由于RAPD引物的随机性以及突变区域的不确定等因素的存在，即使某些果树突变有被RAPD技术鉴定的可能性，这种可能性也很小。因此，RAPD在检测DNA差异较小的无性系变异时难度较大，同时RAPD标记无法鉴定由多倍性引起的芽变【561。3．2扩增片段长度多态性(AFLP)AFLP技术(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片段长度多态性)是由Zabeau和Vos[57】在RAPD和RFLP的基础上发展起来的一种DNA分子标记技术。它充分结合了酶切的稳定性和PCR扩增的灵敏性等特点，具有多态性强，谱带丰富且清晰可辨，试验结果稳定，重复性好等特点。AFLP最适合多态性样品很低的样品检测。Scott等【58】曾成功的应用AFLP技术鉴定了‘Flame’无籽葡萄的一个早熟突变体。李元军等【59】通过AFLP对苹果早熟芽变‘长富2号’与母株进行研究，结果有4对引物在芽变与母株之间产生了差异片段。祝军等1601曾利用AFLP筛选出4对引6鸭梨芽变新品种(Hc)抗黑星病及主要品种特性研究物组合，每对引物组合都能将红富士．短枝红富士、金冠．金矮生、元帅．新红星和旭一威赛克4对突变系(品种)鉴别开。曾柏全等16l】采用AFLP技术对冰糖橙优良芽变的AFLP分析，在Eoorl．ACG+MseI．CAC引物下，果实性状优良的单株变异与普通对照有明显的带型差异。鲁凤娟等【62】利用AFLP分子标记技术对不同的梨属植物材料进行分析，发现引物组合M7／E5可以将6组芽变完全鉴别，其中M7／E5和M6／E7可以将亲缘关系非常近的鸭梨及其3个芽变品种鉴别开。王斐等【63】对20个梨新品种及其23个亲本进行荧光AFLP技术，扩增结果显示，7对引物组合在29个品种中扩增出特征带，每对引物组合均能将所有品种鉴别开。张小军等【删通过AFLP分析，筛选出47对不同引物组合能成功的检测到‘早酥梨’与其极早熟芽变品种‘六月酥’梨间扩增差异位点。王艳芳等【65】，利用AFLP技术成功鉴别砀山酥梨及其8个营养系变异类型。3．3ISSR分子标记技术OSSR)ISSR(InterSimpleSequ铋ccRepeat，简单序列重复区间扩增多态性)是由Zietkiwiczt661等创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记。在微卫星分子标记基础上发展的，利用基于SSR而设计的寡核苷酸引物来检测2个SSR之间的一段短DNA序列差异。ISSR与RFLP和RAPD相比，具有更高的多态性【67】与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信息；与RAPD相比，ISSR可靠性更好；与RFLP、AFLP相比，它具有快捷、成本低、安全性高的特点。基于上述优点，ISSR分子标记技术已被广泛应用于品种资源鉴定【鸺删、亲缘关系分析【70】、遗传多样性川等方面的研究。Fang掣圮J用ISSR标记区分了33个甜橙品种中的14个和7个葡萄柚品种中的1个，6个柠檬品种中的5个。Monte等【‘73】采用ISSR分子标记技术对24个洋梨品种进行鉴定，供试的8个引物均可将24个品种区分开。宣继萍等【|74】仅用1个ISSR引物IS061就将富士苹果芽变品种与原品种一一区别开，结果表明ISSR既能将芽变品种与原始品种区别，还能将不同的芽变品种相互区别开。程昌凤等【．75】采用ISSR方法对晚熟甜橙芽变等5份材料进行鉴定，结果表明ISSR能有效地鉴定晚熟甜橙芽变。郭长奎等【76】通过ISSR分析，筛选出引物UBC895能成功的把富士芽变优系和长富2号品种清楚地区分开。邱英雄等【_771对杨梅7个品种及2个无性系进行ISSR分析，发现引物16和引物20结合能够区分杨梅的全部品种和无性系。3．4基于逆转座子的分子标记逆转座子在植物基因组中分布广泛，拷贝数多，异质性高，在种内和种间表现出较高的序列差异性和丰富的插入多态性。与常规分子标记技术比较，逆转座子最大的优势在于它能覆盖全基因组，提供的信息更丰富，可作为高通量标记分析，具有很大的发展潜力。7河北农业大学硕士学位(毕业)论文目前基于逆转座子的分子标记有：序列特异扩增多态性(SSAP)¨驯逆转座子一微卫星扩增多态性(REMAP)t791；逆转座子插入位点多态性(RBIP)；逆转座子内部变异多态性(RIVP)和逆转座子内部扩增多态性(IRAP)【s01。逆转座子的活动可能是造成果树芽变的重要原因之一，因此通过基于逆转座子的分子标记技术可以对果树进行芽变鉴定。Sofia等【8l】应用IRAP和REMAP标记技术检测葡萄属Gretl的多态性，在普通琼脂糖胶上均获得了所测各个种及葡萄品种的DNA指纹。Breto等捧2J采用RAPD、SSR、AFLP和反转录转座子标记对24个克里曼丁橘品种进行鉴定，其中反转录转座子标记IRAP和REMA发现很多特异的标记，将RAPD、SSR及AFLP分子标记不能区分的不同的芽变品种区别开来。Venmri等【s3】对普通嘎啦苹果及其四个芽变品种、“Braeb啪"和其芽变品种“Hillwdl"，采用SSAP检测其逆转座子插入位点邻近序列的DNA变异时，发现芽变与普通品种间存有特异带，表明新的品种可能源于逆转座子插入所产生的芽变。4研究目的与意义鸭梨(PyrusbretschneideriRehd．cv．Yali)属白梨系统，原产于河北，是古老的优质高产品种。鸭梨适应性强但抗梨黑星病能力弱，属高感黑星病品种，梨黑星病的危害常给鸭梨生产造成严重损失。生产中多采用化学农药对其进行防治，但应用化学农药防治病害的弊端已越来越被人们关注。对梨黑星病的防治从长远发展来看，选用抗病品种不仅可以减少农药对环境的污染，降低病菌对农药的抗性，最为重要的是果实农药残留降低和果实品质提高。鸭梨距今栽培历史已有千年，在长期的栽培过程中，会自发的产生新变异类型。我国现已从不少鸭梨产区筛选到优良芽变品系和优良单株[21。从鸭梨自然突变体中选育既抗黑星病又能保持鸭梨优良品质的芽变品系或单株，是目前解决鸭梨发生黑星病最经济、最有效和最安全的。鸭梨Hc疑似普通鸭梨芽变新品种，经田间数年观察，鸭梨Hc为高抗黑星病类型。随后用其枝条进行嫁接，嫁接树在生长的各个阶段均表现对黑星病较强的抗性，而且果实品质优良。因鸭梨Hc为田问首次发现的鸭梨品种，故未对其进行系统研究。本研究以抗黑星病鸭梨Hc为试验材料，分别从叶片形态结构、生理生化指标及分子生物学等方面进行系统研究，旨在了解其抗黑星病的抗病机制、鉴定和克隆抗黑星病相关功能基因。以上各项研究，不仅在梨抗黑星病机制方面具有重要的理论意义，同时也是高抗黑星病鸭梨Hc推广应用以及梨抗黑星病基因应用的重要理论基础，具有显著的实际应用价值。8鸭梨芽变新品种(Hc)抗黑星病及主要品种特性研究第二章梨黑星菌离体培养梨黑星病是梨树重要病害之一，梨树受该菌侵染后，常造成梨品质和产量下降。造成我国梨黑星病的病原菌是VenturianashicolaTanakaetYamarnoto。它是一种营养要求严格的真菌，分离培养较困难，分离培养时菌丝体生长缓慢，产孢量少。该菌上述特点严重制约了利用该菌进行抗病品种的鉴定、新农药的室内外药效测定等研究。激素、维生素是生物生长、代谢所必需的微量物质。过去，在对食用菌菌丝体培养过程中，常通过添加不同激素、维生素等生长调节物质，观测其对菌体生长的影响。此类研究报道较岁s4-85]，但应用生长调节物质培养病原菌，观察对病原菌生长影响的报道尚未出现。本研究首次应用激素、维生素培养梨黑星菌，旨在通过研究几种激素、维生素对梨黑星菌离体培养的影响，筛选出对梨黑星菌生长具有促进作用的激素或维生素，确定其最佳添加浓度。为鉴定抗梨黑星病梨树新品种及筛选新型农药，提供充足的试验材料、缩短试验周期。l材料与方法1．1材料1．1．1菌种梨黑星菌(VenturianashicolaTanakaetYamamoto)l主l南京农业大学提供。菌种转接于PDA平板上进行培养。1．1．2培养基PDA培养基：马铃薯2009：葡萄糖159；琼脂粉159：蒸馏水1000ml汹3。1．1．3药剂激素类：a一萘乙酸(a-NAA)、2，4．D、激动素(KD、6-BA、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)。维生素类：维生素C、维生素Bl。以上药剂均由保定博润生物试剂公司提供。1．2方法1．2．1不同激素、维生素比较选择试验参考激素类物质和维生素类物质的性质、作用特点及相关文献【871，将供试药剂的浓度均设定为lmg／L进行选择试验。以PDA作为基础培养基，向其中分别添加a-NAA、2，4一D、KT、6-BA、认A、GA3六种激素和维生素C、维生素Bl两种维生9河北农业大学硕士学位(毕业)论文素制成PDA综合培养基。将由PDA平板上保存的梨黑星菌菌种制成直径2mm的茵饼，分别接种于上述PDA综合培养基平板上，同时以空白PDA为对照，每处理均设3次重复。在20℃，相对湿度80％的人工气候箱内进行黑暗培养，于7d、14d、21d、28d分别测量菌落平均直径和产孢量。采用十字交叉法测量菌落的生长直径。产孢量的测定，参考钮绪燕等【8引对梨黑星菌产孢量的测定方法，用直径2mm铁丝环罩住待测菌落，滴入125此蒸馏水，然后用刀片轻刮菌落表面，用滴管反复吸放至孢子打散，制片镜检。每菌落检查10个视野，计算菌落平均产孢量。1．2．2a．萘乙酸用量选择试验以PDA为基础培养基，向其添加不同浓度的a-NAA。浓度分别设置为lmg／L、2mg／L、5mg／L、10mg／L、20mg／L、40mg／L、80mg／L、160mg／L、320mg／L九个浓度梯度。将直径2mm的梨黑星菌菌饼接种于含不同浓度a-NAA的PDA综合培养基平板上，同时以空白PDA为对照，每处理均设3次重复，置于20℃，相对湿度80％的人工气候箱内进行黑暗培养，于7d、14d、21d、28d分别测量菌落平均直径。2结果与分析2．1不同激素、维生素对梨黑星菌生长的影响不同激素、维生素对梨黑星菌生长影响比较试验结果(表2．1)表明，a-NAA、2，4_D、KT、6．BA、维生素C以及维生素Bl均可促进梨黑星菌菌丝生长，28d菌落直径均大于对照；添加GA3、L蛆的培养基菌丝生长缓慢，菌落直径小于对照。梨黑星菌在含有a-NAA的培养基上菌丝生长最快，28d菌落直径可达23．77rnrn。在添加其他激素、维生素的培养基上，菌落直径一般为18mm。经多重比较后，除a-NAA与对照表现差异极显著外，其余激素、维生素均与对照无极显著差异。因此，促进梨黑星菌生长的最佳激素为a-NAA。在接种后7d、14(1、21d、28d分四次观察记录各处理菌落的产孢量，镜检结果所有处理产孢量为0。2．2不同浓度a．萘乙酸对梨黑星菌生长的影响生长调节物质都具有低浓度促进生长，高浓度抑制生长的特性。从表2．2可知，低浓度a-NAA促进梨黑星菌菌丝生长，高浓度则抑制菌丝生长。当a-NAA浓度在1．80mg／L时，梨黑星菌菌落直径大于对照；当a．NAA为160-320mg／L时，梨黑星菌生长受到抑制，菌落直径小于对照。a-NAA浓度为10mg／L时，梨黑星菌生长速度最快，菌落直径最大，28d直径可达25．17mm。经多重比较，在P=0．01水平下，a-NAA浓度为10mg／L分别与2mg／L、5mg／L、20mg／L、40mg／L之间差异不显著，但与对照存在极显著差异；在P=0．05水平下，浓度为10mg／La-NAA与其他各个处10鸭梨芽变新品种(Hc)抗黑星病及主要品种特性研究理差异均显著。因此，促进梨黑星菌菌丝体快速生长的最佳激素a-NAA的最适添加浓度为10mg／L。表2．1不同激素、维生素对梨黑星菌生长速率的影响Table．2．1EffectofSeveraldifferenthormonesandvitaminsongrowthrateofVenturianashicolaCKa-NAAKT6．BA2、4．DGA3IAA维生素Bl维生素C1．623．222．171．732．072．031．851．782．587．9012．8018．87BTable．2．2培养时问／dCuImraldate7dckimg／L2mg／L5mg／LloIllg，L20mg／L40mg，L80mg／L160mg，L320mg，L1．783．8l3．203．383．O3．173．203．653．273．oo注：以上数据处理分析采用河北农业大学硕士学位(毕业)论文3结论与讨论本研究通过向PDA培养基中添加不同激素、维生素制成综合培养基对梨黑星菌进行离体培养，最终筛选出附加10mg／La-NAA的PDA培养基，可快速促进梨黑星菌生长，28d菌落直径可达25．17mm。梨黑星菌人工培养生长较慢，一般在15．18℃条件下，培养10d菌落直径仅1-2mm。钮绪燕等【39】对梨黑星菌离体培养基质的研究表明，梨黑星病菌在PDA+熟梨块培养基上生长最快，20d菌落直径为12ml"n。本试验通过向PDA中添加生长调节物质，可有效促使梨黑星菌的生长，