蛋白水解度测定方法蛋白水解度测定方法
蛋白水解度(DH)测定方法—OPA法
一、 定义
水解度(DH)是指蛋白质中被水解的肽键占总肽键的百分比。其基本计算公式如下:
DH=被水解的肽键数蛋白质总肽键数×100%=h×100% htot 的值根据不同的底物蛋白会有所不同,h是用等价serine NH2表示的。
ℎ=𝑆𝑒𝑟𝑖𝑛𝑒 𝑁𝐻2−𝛽𝛼 meqv/g protein
更多α,β,htot的精确数值请参见备注。
此处的DH是指样品相对于原始底物的水解度,如果要计算水解反应前后的水解度,需要使用如下公式:
DH=h1−h0×1...
蛋白水解度测定方法
蛋白水解度(DH)测定方法—OPA法
一、 定义
水解度(DH)是指蛋白质中被水解的肽键占总肽键的百分比。其基本计算公式如下:
DH=被水解的肽键数蛋白质总肽键数×100%=h×100% htot 的值根据不同的底物蛋白会有所不同,h是用等价serine NH2
示的。
ℎ=𝑆𝑒𝑟𝑖𝑛𝑒 𝑁𝐻2−𝛽𝛼 meqv/g protein
更多α,β,htot的精确数值请参见备注。
此处的DH是指样品相对于原始底物的水解度,如果要计算水解反应前后的水解度,需要使用如下公式:
DH=h1−h0×100% h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度;
h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。
二、 原理
OPA(邻苯二甲醛)法测定蛋白质水解度的原理是OPA在β-巯基乙醇的存在下会与自由α-氨基形成黄色化合物,其在340nm处有特征吸收,用分光光度计可检测其OD值。实际使用中1,4二巯基苏糖醇(DTT)比β-巯基乙醇更易使用。
三、 试剂
测试所需试剂及设备如下:
硼砂 (CAS 1303-96-4) AR
十二烷基硫酸钠(SDS, CAS 151-21-3) AR
邻苯二甲醛(OPA,CAS 643-79-8,纯度97%) (sigma)
1,4-二巯基苏糖醇(DTT,CAS 3483-12-3,纯度99%) (sigma)
丝氨酸(serine)标准品 (CAS 302-84-1) (sigma)
紫外可见分光光度计(可测340nm吸光值)
容量瓶100ml,200ml,500ml各数个
10ml测试管数个
3.1 OPA试剂
A1. 将7.620g硼砂(CAS 1303-96-4)和200mg十二烷基硫酸钠(SDS)溶解于
150ml去离子水中。溶解完全后方可加入其他试剂。
A2. 将160mg邻苯二甲醛(OPA,纯度97%)溶解于4ml无水乙醇中。溶解完全后
将此OPA溶液转移至上述A1溶液中,并用去离子水冲洗,转移。
A3. 将176mg 1,4-二巯基苏糖醇(DTT,纯度99%)加入到A1溶液中,去离子水冲
洗,转移。
A4. 用去离子水将A1溶液定容至200ml.
此试剂现配现用。
3.2 丝氨酸标准溶液
将50mg丝氨酸(serine)溶解于500ml去离子水中。此溶液中Serine-NH2约为
0.9516 meqv/L.
3.3 样品溶液
将Xg样品溶解于100ml去离子水中,X的值在0.1~1.0之间。
如果样品蛋白含量为80%,则X取0.1g,如果样品蛋白含量为8%,则X取1.0g。
*水解实验中可取100ul水解样品加入到900ul,5%(W/W)热的(85℃)SDS溶
液中,保温5min灭酶。样品保存在-18℃以备测试。计算时注意蛋白浓度的变化。
四、 测试步骤
使用分光光度计测试所有样品的340nm吸光值,空白对照为去离子水。
1. 加3ml OPA试剂到所有的测试管中。
分析一个样品所需的测试管:
标准溶液 4个
空白 4个
样品溶液 2×2个
每个样品须测2次,每次需有一个平行样,故需4个测试管。
2. 标准溶液测试
将400ul丝氨酸标准溶液加入到一个装有3mlOPA试剂的测试管中(时间点0),混合均匀(5S)后精确静置2min后立即读取340nm的吸光值。
在测空白和样品值之前测2个标准品,另2个标准品在测完空白和样品后再测。标准品的吸光值取4次的平均值。
一般情况下ODstand.≈0.8
3. 空白测试
将400ul去离子水加入到一个装有3mlOPA试剂的测试管中(时间点0),混合均匀(5S)后精确静置2min后立即读取340nm的吸光值。
测4次空白取平均值。一般情况下ODblank≈0.07。
*如果用5% SDS溶液取样灭酶,则空白就是5% SDS溶液。
4. 样品测试
将400ul样品溶液加入到一个装有3mlOPA试剂的测试管中(时间点0),混合均匀(5S)后精确静置2min后立即读取340nm的吸光值。
因为吸光值会随时间变化,所以读取OD值的时间必须是同样的(2min)。
五、 计算
5.1 计算h
Serine NH2=
Serine NH2
X
P
0.1 𝑂𝐷𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒−𝑂𝐷𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑂𝐷𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑.−𝑂𝐷𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘∗0.9516meqv/L∗0.1∗100𝑋∗𝑃 𝐿/𝑔𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 meqv serine NH2/g protein g sample (0.1~1.0g) protein % in sample sample volume in L
𝛼
各底物的α和β具体数值见附表。
如果未对底物进行测试,α和β可按1.00和0.40粗略计算。
5.2 计算DH
ℎ1−ℎ0 h=𝑆𝑒𝑟𝑖𝑛𝑒 𝑁𝐻2−𝛽ℎ𝑡𝑜𝑡
h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度;
h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。
DH=*100%
备注:
大豆、面筋、酪蛋白、乳清、明胶、肉、鱼
OD值在0.2~1.2之间的读数会比较准确,太小或太大精确度都会有影响。因此须注意丝氨酸标准品浓度和样品中蛋白浓度是否合适。
Reference
P.M. Nielsen, D.Petersen, and C. Dambmann, 2001. Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis. Journal of Food Science Vol.66 NO.5 (642-646)
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