蛋白水解度测定方法

蛋白水解度测定方法 蛋白水解度（DH）测定方法—OPA法 一、 定义 水解度（DH）是指蛋白质中被水解的肽键占总肽键的百分比。其基本如下： DH=被水解的肽键数蛋白质总肽键数×100%=h×100% htot 的值根据不同的底物蛋白会有所不同，h是用等价serine NH2示的。 ℎ=𝑆𝑒𝑟𝑖𝑛𝑒 𝑁𝐻2−𝛽𝛼 meqv/g protein 更多α，β，htot的精确数值请参见备注。 此处的DH是指样品相对于原始底物的水解度，如果要计算水解反应前后的水解度，需要使用如下公式： DH=h1−h0×100% h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度； h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。 二、 原理 OPA（邻苯二甲醛）法测定蛋白质水解度的原理是OPA在β-巯基乙醇的存在下会与自由α-氨基形成黄色化合物，其在340nm处有特征吸收，用分光光度计可检测其OD值。实际使用中1，4二巯基苏糖醇（DTT）比β-巯基乙醇更易使用。 三、 试剂 测试所需试剂及设备如下： 硼砂 （CAS 1303-96-4） AR 十二烷基硫酸钠（SDS, CAS 151-21-3） AR 邻苯二甲醛（OPA，CAS 643-79-8，纯度97%） （sigma） 1,4-二巯基苏糖醇（DTT，CAS 3483-12-3，纯度99%） （sigma） 丝氨酸（serine）标准品 （CAS 302-84-1） （sigma） 紫外可见分光光度计（可测340nm吸光值） 容量瓶100ml，200ml，500ml各数个 10ml测试管数个 3.1 OPA试剂 A1. 将7.620g硼砂（CAS 1303-96-4）和200mg十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于 150ml去离子水中。溶解完全后方可加入其他试剂。 A2. 将160mg邻苯二甲醛（OPA，纯度97%）溶解于4ml无水乙醇中。溶解完全后 将此OPA溶液转移至上述A1溶液中，并用去离子水冲洗，转移。 A3. 将176mg 1,4-二巯基苏糖醇（DTT，纯度99%）加入到A1溶液中，去离子水冲 洗，转移。 A4. 用去离子水将A1溶液定容至200ml. 此试剂现配现用。 3.2 丝氨酸标准溶液 将50mg丝氨酸（serine）溶解于500ml去离子水中。此溶液中Serine-NH2约为 0.9516 meqv/L. 3.3 样品溶液 将Xg样品溶解于100ml去离子水中，X的值在0.1～1.0之间。 如果样品蛋白含量为80%，则X取0.1g，如果样品蛋白含量为8%，则X取1.0g。 *水解实验中可取100ul水解样品加入到900ul，5%（W/W）热的（85℃）SDS溶 液中，保温5min灭酶。样品保存在-18℃以备测试。计算时注意蛋白浓度的变化。 四、 测试步骤 使用分光光度计测试所有样品的340nm吸光值，空白对照为去离子水。 1. 加3ml OPA试剂到所有的测试管中。 分析一个样品所需的测试管： 标准溶液 4个 空白 4个 样品溶液 2×2个 每个样品须测2次，每次需有一个平行样，故需4个测试管。 2. 标准溶液测试 将400ul丝氨酸标准溶液加入到一个装有3mlOPA试剂的测试管中（时间点0），混合均匀（5S）后精确静置2min后立即读取340nm的吸光值。 在测空白和样品值之前测2个标准品，另2个标准品在测完空白和样品后再测。标准品的吸光值取4次的平均值。 一般情况下ODstand.≈0.8 3. 空白测试 将400ul去离子水加入到一个装有3mlOPA试剂的测试管中（时间点0），混合均匀（5S）后精确静置2min后立即读取340nm的吸光值。 测4次空白取平均值。一般情况下ODblank≈0.07。 *如果用5% SDS溶液取样灭酶，则空白就是5% SDS溶液。 4. 样品测试 将400ul样品溶液加入到一个装有3mlOPA试剂的测试管中（时间点0），混合均匀（5S）后精确静置2min后立即读取340nm的吸光值。 因为吸光值会随时间变化，所以读取OD值的时间必须是同样的（2min）。 五、 计算 5.1 计算h Serine NH2= Serine NH2 X P 0.1 𝑂𝐷𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒−𝑂𝐷𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑂𝐷𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑.−𝑂𝐷𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘∗0.9516meqv/L∗0.1∗100𝑋∗𝑃 𝐿/𝑔𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 meqv serine NH2/g protein g sample (0.1~1.0g) protein % in sample sample volume in L 𝛼 各底物的α和β具体数值见附表。 如果未对底物进行测试，α和β可按1.00和0.40粗略计算。 5.2 计算DH ℎ1−ℎ0 h=𝑆𝑒𝑟𝑖𝑛𝑒 𝑁𝐻2−𝛽ℎ𝑡𝑜𝑡 h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度； h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。 DH=*100% 备注： 大豆、面筋、酪蛋白、乳清、明胶、肉、鱼 OD值在0.2～1.2之间的读数会比较准确，太小或太大精确度都会有影响。因此须注意丝氨酸标准品浓度和样品中蛋白浓度是否合适。 Reference P.M. Nielsen, D.Petersen, and C. Dambmann, 2001. Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis. Journal of Food Science Vol.66 NO.5 (642-646)