免疫组化技术常见问题及处理方法

免疫组化技术常见问及处理方法免疫组织化学的定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术免疫组织化学的原理根据抗原抗体反应和化学显色原理组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合利用一抗与标记生物素（HRP、AKP）、荧光素等的二抗进行反应通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成分的分布和含量免疫组织化学的分类按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、荧光标记和放射性标记等按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测可被检测的物质组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测免疫组织化学的特点1）特异性强2）敏感性高3）定位准确、形态与功能相结合Westernblotting、ELISA与免疫组化的异同Westernblotting：蛋白质免疫印迹，检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位，但敏感性远远低于免疫组化技术ELISA：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一免疫组织化学方法的基本步骤组织和细胞的处理抗原修复染色鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清）鼠单克隆抗体特异性较高背景较干净有多种潜在用途但敏感性、亲和力低兔多克隆抗体（兔抗血清）高敏感性、亲和力可能有较多的交叉反应更多的潜在用途SP法1.石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。2.根据每一种抗体的，对组织抗原进行相应的修复。3.每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。4.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。5.除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min，PBS冲洗3次，每次3分钟。6.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。7.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。8.除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-10分钟。9.自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。10.如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。二步法(Envision系统)1）脱蜡、水化组织切片。2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。4）滴加一抗，室温或37℃孵育30-60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。5）滴加enhangcer增强剂（试剂A），37度30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体（试剂B），室温37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次。7）应用DAB溶液显色。8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。Envision系统的优点敏感性高背景干净（消除内源性生物素的干扰）步骤简单石蜡切片标本的固定1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果4、固定液的量要超过组织体积5倍以上如果组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失固定不充分标本的取材、脱水、浸蜡标本的取材厚度以2mm为宜梯度酒精脱水尽量彻底充分二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组织发硬发脆浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷，而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片标本的切片、捞片、烤片切片通常以3～4um的厚度为宜,太厚易掉片，细胞重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（48～50℃）80℃烘烤1～2h玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性冰冻切片的处理冰冻切片的组织抗原保存好通常以5um的厚度为佳冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4℃冰箱短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细胞肿胀等现象细胞涂片的处理培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固定2遍，4℃或－20℃冰箱保存抗原修复概念:应用物理或化学的方法将组织固定过程中封闭的抗原决定簇修复暴露的过程称为抗原修复原因：甲醛固定过程中形成醛键和羧甲基而封闭部分抗原决定簇，固定时，蛋白与蛋白之间发生交联,可能会封闭抗原决定簇抗原修复的方法酶消化：如胰蛋白酶、蛋白水解酶热抗原修复（HIER）：水浴；微波炉；高压锅；高压消毒锅；蒸汽室超声波以上综合运用修复方法从强到弱为：高压修复、微波修复、胰酶修复热抗原修复更有效：染色结果更一致，操作更单一事先确定的热修复时间可适用于几乎所有的组织一抗可以进一步稀释（节省费用）有些抗体只有采用热抗原修复才有效高压锅热抗原修复比微波更有效能处理大批量的切片达到更高的温度加热均匀（不像微波炉有热点和冷点）和节省时间高压锅热抗原修复将高压锅中的缓冲液煮开（不加盖）将切片放入沸腾的缓冲液盖紧盖子和高压阀，加热至全压力达到全压力后才能计时，最佳时间由各个实验室自行确定----通常在2-4分钟热抗原修复：注意事项无论哪一步都不要让切片干涸（抗原可完全丢失）加热后需要冷却15～30分钟（个别未折叠的蛋白链恢复到原来的构型）热抗原修复存在的问题过度的热修复会导致组织形态的破坏或组织完全消化，免疫染色变弱或定位不准确有一个时间点，超过这个时间点进一步热修复也不会获得更强的染色效果解决方法：采用较短时间热修复或酶消化重复实验修复过度的实验组修复过度的实验组修复过度的对照组修复过度的对照组酶消化修复缩短修复时间热修复抗原会导致内源性生物素反应增强，应用卵白素抗生物素系统会产生假阳性　　富含内源性生物素的组织：　　—肝细胞　—线抗体丰富的组织如肾脏、甲状腺、嗜酸细胞等　　—胞浆丰富的肿瘤细胞热抗原修复的问题：内源性生物素组织在热修复之后，用3％的新鲜H2O2进行封闭，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min，再用10％鸡（鸭）蛋清阻断10～15分钟，清洗后滴加一抗应用非生物素系统的检测试剂盒，如EnVision系统阻断内源性生物素的方法热抗原修复的缓冲液pH6.0柠檬酸缓冲液（最常用）、尿素、Tris-HCl、商品化修复液等碱性pH修复液常对绝大多数抗体的效果更好推荐使用：EDTA缓冲液pH8.0或Tris-EDTA缓冲液pH9.0是较好的常规修复液，可用于大多数热修复有效的抗体抗体孵育条件主要抗体浓度、温度、时间，三者一般是相互成反比的（相对）浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度，时间决定反应的量温度有4度、室温、37度，其中4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温不太提倡4度过夜和从冰箱拿出后需37度复温45min复温的必要性防止切片从4度直接放入PBS易脱片使抗原抗体结合更稳定4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色脱片产生的原因和如何防止脱片多聚赖氨酸玻片的质量问题切片问题：切片较厚或者不均匀组织本身的问题：癌症组织中坏死组织越多越容易脱片烤片的时间短、温度不够操作的时候甩的过猛，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用吸水纸从边缘上慢慢吸水修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长，玻片架放进沸腾的修复液时需轻柔背景染色较深的原因（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，避免因遗忘而造成时间延长。时间和温度要根据染色结果进行调整（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应（4）组织变干（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体DAB染色后切片着色呈阴性结果抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误抗原修复不全或者不充分组织切片本身这种抗原含量低血清封闭时间过长DAB孵育时间过短细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应DAB显色时间的把握（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗（2）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，说明抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间；或前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间（3）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，说明抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；或封闭时间过长免疫组化对照和质量控制阳性对照阴性对照免疫组化的化外部质量控制体系脱水、透明、封片、拍照脱水、透明要彻底封片时尽量避免留有气泡拍照尽量在两周内拍照尽量选择干净、清晰的视野，无杂质无破碎组织所拍照片尽量在同一种状态下，使背景保持一致照片标识清楚免疫组化染色的评分强度：0分无色1分淡黄色2分棕黄色3分棕褐色细胞数:0分无1分≤10％2分11－50％3分51－75％4分>75％两者乘积>3分为阳性。乘积法：免疫组化染色的评分阳性细胞数的百分比：(+)阳性细胞数<25%(++)阳性细胞数>25%,<50%(+++)阳性细胞数>50%,<75%(++++)阳性细胞数>75%