毕业论文 纳他霉素的分离纯化

#毕业#毕业论文题       目       纳他霉素的分离纯化系  （部）制药与环境系专       业生化制药技术目录-1-1、摘要-3-2、引言-4-3、正文-4-3.1化学性质-5-3.2纳他霉素的抑菌作用机制-5-3.3纳他霉素的生产工艺-5-3.4纳他霉素的提取分离-6-3.5用途-6-3.5.1食品中的应用-6-3.5.2医学上的应用-7- 3.6纳他霉素的发展前景-7-3.7仪器与材料-7-3.7.1仪器-8-3.8方法与结果-8-3.8.1方法-8-3.8.2结果-8-3.9发酵液预处理-8-3.10溶液PH值对纳他霉素溶出率的影响-9-4、实验内容及步骤4.1考察不同PH值下的水和HYPERLINK\l_Toc5287甲醇洗涤初品，对重含提升的影响-9--10-4.2考察PH对发酵液抽提的影响-11-4.3考察不同甲醇盐溶液对发酵液抽提的影响-12-4.3对照试验-13-4.4重复淋洗和搅洗的区别-14-4.5考察抽提时间对抽提效率的影响-14-以及考察结晶物水洗对重含影响-16-4.6考察温度对抽提的影响-18-5、参考文献-19-6、附录摘要目的研究采用甲醇从发酵液中分离纯化得到纳他霉素的工艺，提高纳他霉素成品质量，得到高纯度药用级纳他霉素。方法用HPLC检测方法，以纳他霉素的洗脱液、固体、滤液为指标，考察用甲醇分离纯化纳他霉素的溶解性能和洗脱参数（单位★1及重含★2）。结果纳他霉素含有4个相连的双键结构，决定了纳他霉素几乎不溶于水，微溶于甲醇，溶于冰醇酸。由于纳他霉素的溶解特性，很多用于纳他霉素分离的工艺使用的容积量大，损耗大，成本高，很难实现规模化生产。加之，冰醇酸的制备工艺复杂，以及成本高，故采用甲醇溶液，从发酵液中提取所需产物。纳他霉素从发酵液中的最佳PH值是11；分离纯化纳他霉素成品纯度大于97%。结论该高纯度药用级纳他霉素的规模化分离纯化方法为国内首次应用，工艺简单可靠，分离效果好，适用于工业化生产。关键词：纳他霉素；大孔树脂；分离纯化AbstractObjectivetostudytheisolationandpurificationofmethanolfromfermentationbrothbynatamycinprocess,improvingmyprozinefinishedproductquality,highpuritymedicinalgradeofnatamycin.MethodsHPLCdetectionmethod,withnatamycinelutingliquid,solid,liquidastheindex,isinvestigatedbyusingthemethanolpurificationofnatamycinsolubilityandelutionparameters.Theresultsofnatamycincomprising4connecteddoublebondstructure,determinesthenatamycinisalmostinsolubleinwater,slightlysolubleinmethanol,dissolvingYuBingalkyd.Asaresultofnatamycindissolutioncharacteristics,manyfornatamycinseparationprocessusingvolumebig,lossisbig,costishigh,itisdifficulttorealizelarge-scaleproduction.Inaddition,icealkydcomplexpreparationprocess,andthecostishigh,sotheuseofmethanolsolution,extractionfromfermentationliquidofrequiredproduct.NatamycinfromfermentationbrothintheoptimalpHvalueis11;theseparationandpurificationofnatamycinfinishedmorethan97%purity.Conclusionthishigh-purityformedicinalpurposeslevelacceptshismildewelementtheformalizationseparationpurificationmethodfordomestictoapplyforthefirsttime,craftsimplereliable,theseparationeffectisgood,issuitablefortheindustrializationproduction.Keyword:Acceptshismildewelement;Macroporousresin;Separationpurification引言纳他霉素是一种多烯大环内脂类抗生素，成白色或乳白色，几乎无臭无味，自1955年被Struk等人发现以来，纳他霉素以其优越的抗霉菌、真菌效果，在食品防腐以及医药工业中已有广泛应用。1997年，我国卫生部正式批准纳他霉素用作食品防腐剂。随着对纳他霉素发酵生产研究的不断深入，完善纳他霉素提取工艺就显得尤为重要。Olson等人利用纳他霉素在发酵液中的存在形式，调节PH到酸性除去菌体，在调节PH到中性，离心后得到纳他霉素，提取的纳他霉素纯度大于80%，但该工艺易产生纳他霉素甲酯；Raghoenath等人利用纳他霉素在发酵液中的存在形式，不加入有机溶剂，直接破碎生物量，然后通过重力梯度分离技术提取发酵液中的纳他霉素。该工艺的纳他霉素提取收率大于90%，纯度约70%。以上方法的共同点就是要求发酵液中的纳他霉素的浓度较高，一般约在10g/L的含量是最为适宜。但当那他霉素含量较低时，若采用以上这些方法则不能达到满意的提取效果。基于以上的考虑，本文这种研究了纳他霉素浓度在一般情况下（2g/L-5g/L）范围内的产品提取工艺，并采用HPLC图谱和生物活性检测法对提取产物进行了分析鉴定；该工艺能够把重含提高到95%，纯度也能上96%。此方法也正是我作为本次毕业论文的主题。纳他霉素在水或低级醇中的溶解度差别很大，工业上常用甲醇等有机溶剂从发酵液中提取。但到目前为止，纳他霉素在水相中溶解度数据很难找到，在有机溶剂中的溶解度数据更是未见报道。此外，为减少有机溶剂残留于产品中队人体造成危害、对环境污染节约工业成本，应在提取过程中尽量减少有机溶剂的用量。初步筛选表明纳他霉素在甲醇中溶解效果最佳。因此，本工艺研究决定采用甲醇从发酵液中提取纳他霉素。此外，由于本次提取需要用到大量甲醇，公司在研究过程中除了考虑环境角度以外，还从生产工人的人生安全出发，采用冷甲醇来进行提取。结果效果非常明显，效率也得到大大提高。正文3.1化学性质纳他霉素是多烯大环内脂类抗真菌抗生素，为白色乳白色无臭无味的结晶粉末。分子式分子式C33H47NO13，分子量为665.73g/mol。其结构如图1所示图1化学名称：(1R,3S,5R,7R,8E,12R,14E,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-[(3-amino-3,6-dideoxy-D-mannopyranosyl)oxy]-1,3,26-trihydroxy-12-methyl-10-oxo-6,11,28-trioxatricyclo[22.3.1.0]octacosa-8,14,16,18,20-pentaene-25-carboxylicacid标识：CAS号：7681-93-8ATC编码：A01AB10A07AA03,D01AA02,G01AA02,S01AA10PubChem：CID441382DrugBank：APRD01136ChemSpider：10468784ChEMBL：CHEMBL1200656纳他霉素是纳他尔链霉菌素、恰塔努加链霉菌或褐黄孢链霉菌等微生物的次生代谢产物，从发酵液中提取纯化后获得。纳他霉素是一种高效、低毒的光谱抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和藻类剂，可以用于与医疗、食品、饲料、粮储防霉，特别是在食品原料保鲜、食品防腐等方面具有良好的使用。纳他霉素是两性物质，分子中.含有一个碱性基团和一个酸性基团，其电离常数PKa值为8.35和4.6相应的等电点是6.5。由于纳他霉素含有4个相连的双键结构，决定了纳他霉素几乎不溶于水，微溶于甲醇，溶于冰醇酸。由于纳他霉素的溶解特性，很多用于纳他霉素分离的工艺使用的容积量大，损耗大，成本高，很难实现规模化生产。本次项目采用甲醇从发酵液中将目的产物分离、富集、结晶、干燥，在国内首次实现规模化的高纯度药物用级纳他霉素的分离纯化，实现产品质量符合国家药典要求，收率稳定，设别投资少，适于工业化生产。微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，难溶于大部分有机溶剂。在pH值高于9或低于3时，其溶解度会有所提高，在大多数食品的PH范围内非常稳定。纳他霉素具有一定的抗热处理能力，在干燥状态下相对稳定，能耐受短暂高温（100℃）；但由于它具有环状化学结构、对紫外线较为敏感，故不宜与阳光接触。纳他霉素活性的稳定性受PH值、温度、光照强度和氧化剂及重金属的影响，所以产品应该避免与氧化物及硫氢化合物等接触。3.2纳他霉素的抑菌作用机制 纳他霉素是26种多烯径大环内酯类抗真菌剂的一种,多烯是一平面大环内酯环状结构,纳他霉素分子的疏水部分即大环内酯的双键部分以范德华力和真菌细胞质膜上的甾醇分子结合,形成抗生素---甾醇复合物,破坏细胞质膜的渗透性;分子的亲水部分即大环内酯的多醇部分则在膜上形成水孔,损伤膜的通透性,从而引起菌内氨基酸、电解质等重要物质渗出而死亡。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些类甾醇化合物,所以纳他霉素对细菌没有作用3.3纳他霉素的生产工艺他霉素的生产菌种主tanovgensis,Streptomycesnatulonso,Streptomycesgil2vosporeus等3种链霉菌★3。注3杨东靖等根据分子育种中链霉菌产抗生素能力与链霉素抗性基因之间的对应关系,利用链霉素抗性突变作为筛选标记,快速高效地得到了高产菌株56,并对其发酵工艺进行了研究。研究发现56纳他霉素的产量比原始菌种提高了146%。在经过发酵条件优化以后,56的纳他霉素最终产量达到2.81/,是出发菌株产量的170%。3.4纳他霉素的提取分离由于纳他霉素在水或低级醇中的溶解度差别很大，考虑到成本及收率问题，工业上常用甲醇等有机溶剂从发酵液中提取纳他霉素。本工艺着重研究采用甲醇从发酵液中提取纳他霉素。采用HPLC图谱和生物活性检测法对提取产物进行了分析鉴定；该工艺能够把重含提高到95%，纯度也能上96%。3.5用途纳他霉素是一种天然、广谱、高效安全的酵母菌及霉菌等丝状真菌抑制剂，它不仅能够抑制真菌，还能防止真菌毒素的产生。纳他霉素对人体无害，很难被人体消化道吸收，而且微生物很难对其产生抗性，同时因为其溶解度很低等特点，通常用于食品的表面防腐。纳他霉素是目前国际上唯一的抗真菌微生物防腐剂。97年我国卫生部正式批准纳他霉素作为食品防腐剂。目前该产品已经在50多个国家得到广泛使用。主要应用于乳制品、肉制品、发酵酒、饮料果汁，方便食品，烘烤食品，香基等的生产和保藏。3.5.1食品中的应用纳他霉素作为食品防腐剂,应用非常广泛。将山梨酸酯防腐剂,纳他霉素和二羟基碳酸盐组成的抗菌混合物处理饮料和其他食品的制作过程,特别是果汁饮料、钙饮料、茶饮料、含牛奶固型物和蛋白质的饮料等,可以有效防止饮料中微生物学生长。  在酱油中添加15/的纳他霉素,可有效抑制酵母菌的生长与繁殖,防止白花的出现,而且纳他霉素使用成本低,对酱油的品质和风味无任何影响[16]。研究了把纳他霉素和环糊精形成包含络和物,不仅能极大地增加纳他霉素的水溶性,而不影响它的原始结构和抗菌活性,同时便于将纳他霉素溶液均匀喷雾于奶酪表面。发明了纳他霉素和其他抗菌素制成混合的粉剂,用来处理香肠和干酪等食品。这种方法可以将香肠在12e下至少保存60天以上,而不发生霉变。纳他霉素还可以应用干果酱、黄油、桔汁、沙拉酱防霉方面3.5.2医学上的应用最近纳他霉素在医学上,特别是在眼角膜真菌感染方面的研究和报道层出不穷。报道了用纳他霉素和崔西杆菌抗生素油膏治疗真菌性眼角膜溃疡的病例。-[22]研究发现纳他霉素对口腔念球菌的感染有非常明显的治疗效果。将纳他霉素溶液局部使用于眼角膜,发现纳他霉素对由丝状真菌引起的角膜炎也有明显的治疗效果,并且最佳的溶液浓度是5%。报道纳他霉素的治疗由短尾帚霉引起的角膜炎。等报道一位65岁的妇女因为白内障手术后感染黑曲酶引起的眼内炎,对玻璃体内用两性霉素5L,纳他霉素5%,同时以阿托品1%处理,效果明显。有人等用纳他霉素和其他药物综合治疗由于白内障摘除引起的巩膜脓肿,效果明显。  据报道两性霉素和纳他霉素联合治疗由伞状犁头霉引起的新生儿皮肤病。纳他霉素还可用于治疗皮肤及粘液膜疾病,也可应用于阴道及肺曲霉病的治疗。 3.6纳他霉素的发展前景纳他霉素作为一种微生物防腐剂以它安全、天然、健康的特点而倍受人们的关注,各国纷纷投入人力物力对其进行研究。纳他霉素具有许多优点:延长食品的保质期,防止酵母和霉菌引起的变质;减少因为变质而引起的食品回收,降低生产成本;满足消费者对天然食品的要求;不改变食品的风味;低剂量、高效率;抗菌作用时间长等等。敌霉速是由台湾利统股份有限公司出品的高效霉菌、酵母菌抑制剂,主要成份是纳他霉素,可广泛用于各类食品(如乳制品、肉制品、烘焙制品等)保鲜。国内卫生部也已批准使用,敌霉速中纳他霉素含量\50%。纳他霉素作为医学上的高效抗菌剂,目前研究非常多。国外已经有公司生产了商品名为的眼药,用于治疗真菌用引起的眼科疾病。随着纳他霉素生物合成基因簇理解的不断深入,将积极推动采用基因工程技术提高纳他霉素生物合成能力或改造其化学结构的工作,获得了新型纳他霉素衍生物。纳他霉素的研究将一直是一个热点。3.7仪器与材料3.7.1仪器高效液相摄谱仪（996检测器，515泵，waters公司）；Loborata4000旋转蒸发器（Heidolph公司）；PHS-3C型酸度计(上海磁仪器厂)；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；玻璃棒；烧杯；布氏漏斗；填料柱；量筒；抽滤瓶；滤纸；鼓风干燥机；胶头滴管；冰袋；恒温冷凝器；恒温干燥箱；温度计天平；磁力搅拌机；分液漏斗等…3.7.2材料纳他霉素发酵液（公司发酵得到）、纳他霉素标准品（购自美国Sigma公司）、工业乙醇；其它试剂为国产分析纯。3.8方法与结果3.8.1方法HPLC法测定纳他霉素的含量，所需色谱柱：ExtendC18(4.6*250mm，5um)，流动相：乙腈-水-0.01mol/醋酸铵缓冲溶液（70：30）；流速：1.0ml/min；检测波长：303nm，进样量：10um。纳他霉素保留时间为9.2min。发酵液预处理及溶液PH值对纳他霉素溶出率的影响将那他霉素菌丝体在不同pH值的水中搅拌2h，HPLC在线检测，其最佳溶出pH值(25℃)见附录图2。3.8.2结果采用PHLC精密度高、使用方便、准确度高，对样品检测的速度较快，性能也相当稳定。3.9发酵液预处理由于纳他霉素主要存在于菌丝体内，而且发酵液中杂质较多，不利于直接进行抽滤。首先在发酵液中加入珍珠岩，搅拌30min后真空抽滤，水顶洗得到纳他霉素菌丝体。3.10溶液PH值对纳他霉素溶出率的影响提高纳他霉素的成品质量和成品收率，菌丝体内的纳他霉素的溶出率是关键因素，为此根据纳他霉素的两性特征，首先考虑不同PH值下纳他霉素溶出率，找到最佳溶出条件。将纳他霉素菌丝体在不同PH值下的水中搅拌，HPLC在线检测，其最佳溶出PH值（25℃）见图24、实验内容及步骤4.1考察不同PH值下的水和甲醇洗涤初品，对重含提升的影响 试验组1 试验组2 配制0.01mol/L的NaoH溶液100mL 量取纯化水20mL，放入50mL圆底烧瓶中，称取B11112初品2g，研细（取样测试重含），搅拌下加入水中，测定此时PH。 量取纯化水30mL，放入50mL圆底烧瓶中，称取B11112初品3g，研细（取样测试重含），搅拌下加入水中，测定此时PH。 用NaoH溶液（0.01mol/L）调PH至6.8，多次回调，继续搅拌一段时间，测定并记录PH。 用NaoH溶液（0.01mol/L）调PH至6.8，继续搅拌一段时间，测定并记录PH。 过滤，滤饼用纯化水洗涤，取约100mg滤饼至干燥（以五氧化二磷为干燥剂），然后让送样检测重含。 过滤，滤饼用纯化水洗涤，取约100mg滤饼至干燥（以五氧化二磷为干燥剂），然后让送样检测重含。 余下滤饼继续下述实验 过滤，滤饼用适量冷甲醇洗涤，取少量滤饼干燥（以五氧化二磷为干燥剂），然后让送样检测重含。余下滤饼继续下述实验。 量取纯化水适量，置于50mL圆底烧瓶中，将上述滤饼搅拌下加入水中。 用NaoH溶液调节PH至10.0，继续搅拌，测定并记录PH。 过滤，滤饼用纯化水洗涤，然后置于干燥（以五氧化二磷为干燥剂），然后让送样检测重含。 过滤，滤饼用适量水洗涤，再用适量甲醇洗涤。 粗品重含：77.77% 过滤，滤饼用适量甲醇洗涤，然后置于干燥（以五氧化二磷为干燥剂），然后让送样检测重含。 PH6.8洗涤样品重含：79.35% PH6.8洗涤样品重含：84.06% PH10.0洗涤样品重含：88.98% PH10.0洗涤样品重含：83.39% PH＝6.8 PH＝10.0 纯度 95.9% 96.8% 重量 总量为4.8g 4.69g 4.48g 收率 97.9% 93.4%4.2考察PH对发酵液抽提的影响 1 配制1moL/L的盐酸溶液100ml待用 2 配制1moL/L的氢氧化钠溶液100ml待用 3 取发酵液800ml，测定ph，放入1L烧杯中搅拌下加热至60℃，并保持20min。 4 加入400ml自来水，然后用盐酸(1mol/l)搅拌下调ph至4.2，冷却一段时间 5 再加入少量珍珠岩搅拌均匀，静置一段时间 6 过滤，滤饼用水洗涤 7 滤饼粉碎分散后干燥，放冷，称重 8 菌丝重量4倍（w/v）的冷甲醇，加入菌丝，搅拌一段时间 9 过滤压干，用菌丝量30%的冷甲醇洗涤。滤液和洗涤液均记录体积并取样测试单位。 10 滤饼重量4倍（w/v）的冷甲醇溶液（含氯化钙），加入菌搅拌一段时间。 11 过滤压干，得抽提液①，记录体积并取样测试抽提单位 12 滤饼重量2倍（w/v）的冷甲醇溶液（含氯化钙），加入菌丝，搅拌一段时间。 13 过滤压干，得抽提液②，记录体积单位并取样测试抽提单位 抽提液①和抽提液②分别按照下属操作后处理 1 滤液冷却至低温，缓慢搅拌一段时间 2 保持溶液低温下，加入等体积的水，然后间歇搅拌 3 过滤，结晶用去离子水洗涤，滤干 4 滤饼分别用1倍（w/v）的冷甲醇洗涤，再加入8倍（w/v）的甲醇，低温下洗涤 5 过滤，用1倍（w/v）的甲醇洗涤。抽滤至干。再用冷去离子水洗涤 6 干燥（以五氧化二磷为干燥剂），然后送测重量含量 结果 重含 抽提液1重含为97% 抽提液2重含为86.86% 结论 PH回调后难过滤，单纯度好重含达标，建议不回调PH进行试验4.3考察不同甲醇盐溶液对发酵液抽提的影响 1 取发酵液800ml，测定ph，放入1L烧杯中搅拌下加热至60℃，并保持20min。 2 加入400ml自来水，然后用盐酸(1mol/l)搅拌下调ph至4.2，冷却一段时间。 3 再加入少量珍珠岩搅拌均匀，静置一段时间。 4 过滤，滤饼用水洗涤。 5 滤饼粉碎分散后干燥，放冷，称重。 6 菌丝重量4倍（w/v）的冷甲醇，加入菌丝，搅拌一段时间。 7 过滤压干，用菌丝量30%的冷甲醇洗涤。滤液和洗涤液均记录体积并取样测试单位。 8 滤饼重量4倍（w/v）的冷甲醇溶液（含氢氧化钙），加入菌丝搅拌一段时间。 9 过滤压干，得抽提液①，记录体积并取样测试抽提单位。 10 滤饼重量2倍（w/v）的冷甲醇溶液（含氢氧化钙），加入菌丝，搅拌一段时间。 11 过滤压干，得抽提液②，记录体积单位并取样测试抽提单位。 抽提液①和抽提液②分别按照下属操作后处理 12 滤液冷却至低温，缓慢搅拌一段时间。 13 保持溶液低温，加入等体积的水，然后间歇搅拌。 14 过滤，结晶用去离子水洗涤，滤干。 15 滤饼分别用1倍（w/v）的冷甲醇洗涤，再加入8倍（w/v）的甲醇，洗涤。 16 过滤，用1倍（w/v）的甲醇洗涤。抽滤至干。再用冷去离子水洗涤。 17 干燥（以五氧化二磷为干燥剂），然后送测重量含量。 结果 重含 抽提液1为91.37% 抽提2为92.77% 结论 氢氧化钙不是促进甲醇溶解于水的物质，是结果不合格。4.3对照试验 1 配制1moL/L的盐酸溶液100ml待用 2 取发酵液1000ml，测定ph，放入2L烧杯中搅拌下加热至60℃，并保持20min。 3 加入400ml自来水，然后用盐酸(1mol/l)搅拌下调ph至4.2，冷却一段时间 4 再加入少量珍珠岩搅拌均匀，静置一段时间 5 过滤，滤饼用水洗涤 6 滤饼粉碎分散后干燥，放冷，称重 7 菌丝重量4倍（w/v）的冷甲醇，加入菌丝，搅拌一段时间 8 过滤压干，用菌丝量30%的冷甲醇洗涤。滤液和洗涤液均记录体积并取样测试单位。 9 滤饼重量4倍（w/v）的冷甲醇溶液（含氯化钙），加入菌搅拌一段时间。 10 过滤压干，得抽提液①，记录体积并取样测试抽提单位 11 滤饼重量2倍（w/v）的冷甲醇溶液（含氯化钙），加入菌丝，搅拌一段时间。 12 过滤压干，得抽提液②，记录体积单位并取样测试抽提单位。 13 过滤压干，得抽提液②，记录体积单位并取样测试抽提单位。 抽提液①和抽提液②分别按照下属操作后处理 1 保持溶液低温下，加入等体积的水，然后间歇搅拌。 2 过滤，结晶用水洗涤，滤干。 3 滤饼分别用1倍（w/v）的冷甲醇洗涤，再加入8倍（w/v）的甲醇洗涤。 4 过滤，用1倍（w/v）的甲醇洗涤。抽滤至干。再用冷去离子水洗涤。 5 干燥（以五氧化二磷为干燥剂），然后送测重量含量。 结果 洗涤方式 重含 纯度 重量 收率 一次淋洗 97.5% 96.7% 2.94g 51.6% 四次搅洗 97% 96.1% 1.85g 32.6% 总量 发酵液500ml，单位11700ug/ml总重量为5.85g 结论 一次淋洗收率高，纯度适中，搅洗损失大，不应用搅洗，或是搅洗次数减少。4.4重复淋洗和搅洗的区别 1、取发酵液1500ml，测定ph，放入3L烧杯中搅拌下加热至60℃，并保持20min。 2、加入400ml自来水，然后用盐酸搅拌下调ph至4.2，冷却。 3、再加入适量珍珠岩搅拌均匀，静置一段时间。 4、过滤，滤饼每次用水淋洗，洗涤至滤液基本澄清为止。 5、滤饼粉碎分散后干燥，放冷，称重。 6、菌丝重量4倍（w/v）的冷甲醇，加入菌丝，搅拌一段时间。 7、过滤压干，用菌丝量30%的冷甲醇洗涤。滤液和洗涤液均记录体积并取样测试单位。 8、滤饼重量4倍（w/v）的冷甲醇溶液（含氯化钙），加入菌丝搅拌。9、过滤压干，得抽提液①，记录体积并取样测试抽提单位。 10、滤饼重量2倍（w/v）的冷甲醇溶液（含氯化钙），加入菌丝，搅拌一段时间。 11、过滤压干，得抽提液②，记录体积单位并取样测试抽提单位。 抽提液①和抽提液②分别按照下属操作后处理 1、滤液冷却至低温，缓慢搅拌。 2、保持溶液低温，搅拌下，加入适量水。 3、过滤，结晶用去离子水洗涤，滤干。 4、滤饼分别用1倍（w/v）的冷甲醇洗涤，再加入适量甲醇洗涤。 5、过滤，用1倍（w/v）的甲醇洗涤。抽滤至干。再用去离子水洗涤。 6、干燥（以五氧化二磷为干燥剂），然后送测重量含量。 结果 洗涤方式 重含 纯度 重量 收率 一次淋洗 98.1% 97.6% 3.14g 50.5.1% 四次搅洗 95.4% 96.3% 1.79g 30.6%4.5考察抽提时间对抽提效率的影响以及考察结晶物水洗对重含影响 1、取发酵液1500ml，测定ph，放入3L烧杯中搅拌下加热至60℃，并保持20min。 2、加入400ml自来水，然后用盐酸搅拌下调ph至4.2，冷却。 3、再加入适量珍珠岩搅拌均匀，静置一段时间。 4、过滤，滤饼每次用水搅洗，洗涤至滤液基本澄清为止。 5、滤饼粉碎分散后干燥，放冷，称重。 6、菌丝重量4倍（w/v）的冷甲醇，加入菌丝，搅拌一段时间。 7、过滤压干，用菌丝量30%的冷甲醇洗涤。滤液和洗涤液均记录体积并取样测试单位。 8、滤饼重量4倍（w/v）的冷甲醇溶液（含氯化钙），加入菌丝搅拌。加入菌丝搅拌下每隔一段时间取样HPLC测定重含。 9、过滤压干，得抽提液①，记录体积并取样测试抽提单位。 10、滤饼重量2倍（w/v）的甲醇溶液（含氯化钙）冷却至低温下，加入菌丝，搅拌一段时间。 11、过滤压干，得抽提液②，记录体积单位并取样测试抽提单位。 抽提液①和抽提液②分别按照下属操作后处理 1、滤液冷却至低温，缓慢搅拌。 2、保持溶液低温，搅拌下，加入适量水。 3、过滤，取少量送检验处侧重含，结晶用去离子水洗涤，滤干。 4、滤饼分别用1倍（w/v）的冷甲醇洗涤，再加入适量甲醇洗涤。 5、过滤，用1倍（w/v）的甲醇洗涤。抽滤至干。再用去离子水洗涤。 6、干燥（以五氧化二磷为干燥剂），然后送测重量含量。 抽提时间 时间 15min 30min 45min 60min 75min 90min 单位Ug/ml 15565 17279 17846 20433 22087 26999 结果 总单位ug/ml 总体积ml 总重量g 产物g 重含 纯度 收率 10000 1000 10 5.1 97.9% 98.26% 51% 结论 本次所得实验结果证实抽提时间对收率影响较大，建议延长抽提时间4.6考察温度对抽提的影响 1、取发酵液1500ml，测定ph，放入3L烧杯中搅拌下加热至60℃，并保持20min。 2、加入400ml自来水，然后用盐酸搅拌下调ph至4.2，冷却。 3、再加入适量珍珠岩搅拌均匀，静置一段时间。 4、过滤，滤饼每次用水搅洗，洗涤至滤液基本澄清为止。 5、滤饼粉碎分散后干燥，放冷，称重。 6、菌丝重量4倍（w/v）的一般甲醇，加入菌丝，搅拌一段时间。 7、过滤压干，用菌丝量30%的一般甲醇洗涤。滤液和洗涤液均记录体积并取样测试单位。 8、滤饼重量4倍（w/v）的一般甲醇溶液（含氯化钙），加入菌丝搅拌。加入菌丝搅拌一段时间。 9、过滤压干，得抽提液①，记录体积并取样测试抽提单位。 10、滤饼重量2倍（w/v）的一般甲醇溶液（含氯化钙）冷却至低温下，加入菌丝，搅拌一段时间。 11、过滤压干，得抽提液②，记录体积单位并取样测试抽提单位。 抽提液①和抽提液②分别按照下属操作后处理 1、滤液冷却至低温，缓慢搅拌。 2、保持溶液低温，搅拌下，加入适量水。 3、过滤，结晶用一般去离子水洗涤，滤干。 4、滤饼分别用1倍（w/v）的一般甲醇洗涤，再加入适量一般甲醇，洗涤。 5、过滤，用1倍（w/v）的一般甲醇洗涤。抽滤至干。再用一般去离子水洗涤。 6、干燥（以五氧化二磷为干燥剂），然后送测重量含量。 物质 冷甲醇 一般甲醇 名称 总重 重含 产物重量 收率 纯度 总重 重含 产物重量 收率 纯度 结果 51g 94% 19g 37.2% 98% 51g 93% 21g 41.% 97% 结论 采用冷甲醇的收率及纯度都高于一般甲醇，并且不易造成人体伤害及环境污染，跟利于工业生产。注：本次实习工作主要是纳他霉素的提取工艺，即使开发研究纳他霉素（B11112）工艺条件，故以此作为论文题目，此外，论文内容主要是记录实习期间所学到的知识以及工作中的记录笔记，包括日常的实验室中检测结果。5、参考文献［1］殷昊，吴兆亮，赵艳丽.纳他霉素效价检测和活性研究【J】.食品与发酵工业，2007,33（4）：126-128.［2］康健，王敏，杜连祥，发酵液中的纳他霉素的提取及鉴定【J】.药物生物技术，2006,13（4）：293-298.［3］陈永艳，李彩瑞，杨秀敏，等.高效液相色谱法测定果酱中的纳他霉素【J】.中国食品学报，2008,8（1）：115-118.［4］王春艳，刘树立.纳他霉素的研究概况及其在食品工业中的应用【J】.中国食品添加剂，2007（2）：169.［5］兰碧峰.纳他霉素提取工艺的初步研究【J】.食品工业科技，2008（7）：210.［6］姜爱丽，胡文忠，田密霞，等.纳他霉素在草莓保鲜中应用的研究【J】.食品科学，2007,28（12）：515-520.［7］衰亦承.纳他霉素【J】.中国食品用化学.1997.1（3）：37-41［8］陈冠群，季波.纳他霉素的特性及应用【J】.中国乳品工业，2002,30（4）：26-28.［9］李东，孙健，等．生物食品抗真菌剂一纳他霉素[J1．中国食品添加剂，1995，(4)：26—27.［10］BuchananMA，CiriglianoMC．Foodstufpreservation[P]．USPantenet：6146675，2000：11—14［11］PMichaelDavidson，CraigHDoan．AntimicrobiolinFoods．1993：395—408.［12］邬健国，王敏．纳他霉素的分子生物学研究进展[J]．微生物学通报，2003，30(5)：120—123.［13］凌关庭，等．食品添加剂手册[J1．化学工业出版社，2003［14］PT奥尔森．纳他霉素的连续生产[P]．cN1070688A，1993［15］杜连祥，王敏，路福平，等．纳他霉素的制备方法[P1．cN1515678A，2004［16］OlsonPT，MillisJR，ReimerMH．Natmycinrecovery[P]．USPatent：5591438，1997［17］BordenGW,MaherJM,SklavounosC.Proeessfornatamycinrecovery:[P//US5942611,1999-08-24.6、附录注★1单位：单位是浓度单位；为样品取1mg稀释成10ml，再取稀释液1ml，稀释成10ml,被测物同样稀释倍数，检测出来的结果。样品峰面积×样品浓度×95%×100%注★2重含：重含是一个比值；重含＝对照峰面积×对照浓度×（1-水分%）注★3那他霉素是那塔尔链霉菌(Streptomycesnatalenis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyceschattanoogensis)或褐黄孢链霉菌(StreptomycesgilvosPoreus)等微生物的次生代谢产物。