生物化学技术原理及应用

生物化学技术原理及应用型：1.填空题：（0.5分／空，共20分）2.名词解释：（2分／个，共10分）3.判断题：（1分／题，共20分）4.简答题：（10分／题，共50分）第一章生物大分子物质的制备一.相关概念：1.抽提：用抽提液（常用缓冲液，稀酸，稀碱，有机溶剂例如丙酮，乙醇）进行反复萃取，将原料中有效成分最大限度分离出来的过程。二.知识点：1.理想抽提液具备：有效成分溶解度大，杂质不溶解或溶解度很小，来源广泛，价格低廉，操作安全。2.影响有效成分抽提的因素：溶液PH（偏离等电点的稳定范围内）,离子强度（极性大在离子强度高，极性小在离子强度低），温度（低温0摄氏度时最稳定），搅拌（促使抽提物抽提液相互接触，增加溶解度，采用温和适中的速度，速度慢起不到搅拌作用，速度快产生气泡，使酶变性失活）氧化（氧化剂氧化分子与巯基导致失活，加入还原剂防止氧化），水解酶（蛋白受本身固有水解酶影响，加入抑制剂后使水解酶丧失活性），金属离子（蛋白与金属离子结合生成沉淀复合物，用无离子水或重蒸水配制试剂，配制试剂中加1～3mmol／LEDTA），抽提液与抽提物比例(5:1,抽提液过多有利于有效成分提取，不利于纯化程序。否则，反之)。3.浓缩常用方法沉淀法，吸附法，超过滤法，透析法，离心法，干燥法。4.影响生物大分子保存的主要因素空气（隔绝），温度（低温方面），水分，光线，样品的PH，时间。第二章离心一.知识点：1.离心的基本原理：生物样品悬浮液在高速旋转下，在巨大的离心力作用下，离心力大于悬浮力，使悬浮颗粒以一定的速度沉降下来。2.离心力表示方法：rpf3.离心机的种类：普通离心机（转速小于1000），高速离心机，超速离心机（转速大于2000）。4.离心机主要构件：转子，离心管5.离心基本方法：沉淀离心，差速离心，密度梯度离心6.离心机操作时注意:(1)转速设定，离心力>悬浮力／2。(2)对称于中心的两个离心管重量要平衡。(3)加样量勿超过3/4。(4)对于低温离心机要预先设置低温。(5)离心过程中注意听声音，看仪表。第三章电泳技术一.相关概念：1.电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。2.电泳迁移率：带电粒子在单位时间内移动的距离叫电泳迁移率。3.电渗现象：液体层相对于介质移动的现象。4.两性电解质：所带电荷随着溶液酸碱度的变化而变化，酸性溶液中带正电荷，碱性溶液带负电荷。5.印迹：将生物大分子凝胶转移到物像载体上。二知识点：1.影响电泳分离的主要因素内因：分子量大小，分子形状，分子性质，带电荷量，分子直径。外因：电场强度，溶液PH，溶液黏度，离子浓度，缓冲液性质。2.琼脂糖凝胶聚合原理：依靠琼脂糖上的羟基，在聚合过程中，羟基与羟基上的氢键的聚合。3.PAGE的组成，聚合原理及聚合方式［1］组成：丙烯酰胺（单体）和甲撑双丙烯酰胺（双体交换剂）组成。［2］原理：丙烯酰胺（单体）和甲撑双丙烯酰胺（双体交换剂）为材料，在催化剂作用下，聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之间通过甲撑桥连接而形成的三维网状结构物质。［3］聚合方式：（1）化学聚合法：加入过硫酸铵，当丙烯酰胺，交联剂，四甲基乙二胺的水溶液中加入过硫酸铵，立即产生自由基，丙烯酰胺与自由基作用，随之活化。（2）光催化法：B2作为催化剂，光聚合过程在光激发下催化完成，核黄素在氧及紫外线作用下，生成含自由基的产物，与上述AP作用相同。4.PAGE分离样品时的三种效应：浓缩效应，分离效应，电荷效应。5.SDS-PAGE电泳(变性凝胶电泳)主要成分的作用：（1）甘油或蔗糖：密度大，与样品结合，不发生漂样。（2）SDS:与蛋白质结合，破坏高级结构，破坏氢键，去除蛋白质带电荷差异。（3）巯基乙醇：破坏二硫键，使完整结构变松散。（4）溴酚蓝：电泳指示剂。6.等电聚焦电泳基本原理：小分子进入凝胶内部，流下时路程较长，而大分子物质却被阻排在外部，下来的路程短。7.等电聚焦电泳的基本原理：蛋白质等电点不同，在同一PH下带电荷量不同从而进行分离。8.2D－PAGE的操作顺序：先等电聚焦电泳，再SDS-PAGE.9.Westernblotting的操作步骤：（1）对蛋白质样品电泳分离（2）转膜（3）封闭（4）加入一抗与目的蛋白结合（5）加二抗（6）洗膜（7）膜的光分析。第四章沉淀法一相关概念：1.沉淀：溶液中的物质由液相变成固相析出的过程。二知识点：1.制备蛋白质常用的沉淀方法（1）.盐析法：中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性；加入中性盐后，破坏了水膜暴露出疏水区域；同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体。（2）有机溶剂沉淀法：破坏蛋白质分子表面水化膜；降低水溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的相互作用而使溶解度降低。（3）蛋白质沉淀法（4）聚乙二醇沉淀法：有机物与生物大分子发生共沉淀；使生物大分子脱水而发生沉淀；空间位置排斥将生物大分子挤在一起（5）选择性沉淀法：根据各种蛋白质在不同物理、化学因子作用下稳定性不同的特点，用选择性沉淀法即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。（6）结晶沉淀法（7）等电点沉淀法：等电点易形成沉淀析出，常与盐析法、有机溶剂沉淀法等配合使用。第五章层析技术一相关概念：1.层析：以基质为固定相（呈柱状或薄层状），以液体或气体为流动相，使有效成分和和杂质在这两个相中连续不断，反复多次地进行分配或交换，吸附作用，最终达到分离混合物的目的。2.固定相：位置相对不动，对样品产生保留的一项。它可以是固体物质，也可以是固定于载体上的液体物质；能与待分离的化合物发生可逆的吸附，脱吸附的过程。3.流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体，气体等。柱层析中称为洗脱剂，薄层层析中称为展层剂。4.分配系数：是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用k表示。5.正相色谱：固定相的极性高于流动相的极性，非极性分子或极性大分子先从柱中流出来，分离纯化极性大的分子。6.反相色谱：固定相的极性低于流动相的极性，极性分子或极性小的分子先从柱中流出来，分离纯化极性小的分子。7.操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。二知识点：1.层析方法分类：（1）根据流动相形式不同：液相层析，气相层析（2）根据固定相形式不同：柱层析，纸层析薄层层析（3）根据原理不同：吸附层析，分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析。第六章离子交换层析一相关概念：1.离子交换层析：以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析方法二知识点：1.分离原理：离子交换剂与溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。2.［1］离子交换剂的组成：基质（载体），电荷基团（或功能基团），反离子。［2］离子交换剂的种类：(1)阳离子交换剂：活化处理方式CM纤维素。(2)阴离子交换剂：活化处理方式DEAE纤维素。3.层析操作步骤层析柱的选择➡平衡缓冲液的选择➡装柱➡加样➡洗脱➡收集➡样品的脱盐和浓缩4.洗脱方式单一洗脱法（适用于组分简单），阶段洗脱法，连续洗脱法（最常用）第七章吸附层析法一相关概念：1.吸附层析法：以多孔凝胶填料为固定相，利用分子筛功能将分子大小不同的样品组分加以分离的方法。二知识点：1.分离原理：在吸附剂表面存在着许多随机分布的吸附位点，这些位点通过范德华力和静电引力与蛋白质核酸等生物分子结合，混合物在层析柱不断吸附，解吸再吸附即在固定相和流动相中连续分配，从而达到分离效果。2.常见的吸附剂有：羟基磷灰石，硅胶，活化氧化铝－硅胶，活性炭，大孔吸附树脂。3.依据层析方式不同，吸附层析法的种类:柱层析，薄层层析。4.薄层层析的操作步骤：1、薄层板的制备2、点样3、展层4、显色5、检测第八章凝胶层析法一相关概念：1.凝胶层析法：以多孔凝胶填料为固定相，利用分子筛功能将分子大小的样品组分加以分离的方法。2.外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即流动相的体积。3.内水体积：凝胶颗粒中孔穴的体积。4.柱床体积：凝胶柱中所能容纳的体积。5.排阻极限：指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。6.吸水率：1g干凝胶吸收水的体积或重量，但不包括颗粒间的吸附水分。二知识点:1.分离原理：凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部，当一混合溶液通过，凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量筛分开了。2.常见的凝胶有：葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，交联葡聚糖与双丙烯酰胶共聚凝胶，琼脂糖凝胶，交联琼脂糖凝胶。第九章免疫层析一.相关概念：1.抗原：指进入异种机体后，能致敏淋巴细胞、能与抗体发生特异结合的物质。抗原与抗体结合的特异性称为抗原性。2.抗体：机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，又称免疫球蛋白。3.免疫佐剂：先于抗体或与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质。4.半抗原：有些小分子物质只有抗原特异性而无免疫原性故称半抗原。二知识点：1.抗原性包括：免疫原性和抗原特异性。2.一个良好的抗原应具备的条件：分子足够大，外源性强，结构尽量复杂，可降解性好。3.人类抗体的种类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。4.佐剂的种类：无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂。5.单克隆抗体产生的机制：［1］骨髓瘤细胞的特征：骨髓瘤细胞是一种恶变细胞。它在体外有无限的增殖力，并能分泌很多化学结构均一的免疫球蛋白，但特异性较差。当它与不同性质的动物脾细胞融合时，可形成杂交瘤细胞株。该细胞株在HAT培养基中生长良好，而骨髓瘤细胞则在HAT培养基中不能生长。［2］脾细胞的特点：经免疫的动物细胞，不能在体外增殖，但是能产生相应的特异抗体，能与骨髓瘤细胞融合，并形成可分泌单克隆抗体的细胞株。［3］单克隆抗体的产生：把骨髓瘤细胞和经免疫的鼠脾细胞置于聚乙二醇中融合，然后在HAT培养液中选择培养。骨髓瘤细胞和动物脾细胞在聚乙二醇的作用下发生融合，在HAT培养基中骨髓瘤细胞，没有融合的脾细胞均不能进行增长繁殖，只有骨髓瘤细胞－脾细胞融合体才能发生增殖，增殖过程中产生单个细胞株，单个的细胞株在培养的过程中，脾细胞分泌一些免疫性物质。第十章亲和层析法一相关概念：1.亲和层析：利用生物分子间所具有的专一而可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的方法。二知识点：1.分离原理：以亲和吸附剂为固定相，以特异性溶液为流动相，欲分离物质通过在固定相所装的层析柱时，借助静电引力，范德华力，结构互补效应等作用，使待分离的物质吸附在固定相上，不吸附的被平衡缓液洗涤出来形成第一个层析峰。然后，改变缓冲溶液PH或增加离子强度等方式将有效成分从固定相上解离下来形成第二个层析峰。2.亲和吸附剂的结构：基质--间隔臂分子--配体第十一章气相色谱法一相关概念：1.气相色谱法：以气体为流动相的色谱分离技术。2.载气：是指沿着固定相移动的惰性气体。3.固定液：在担体或毛细管表面均匀涂渍的有机化合物液膜称为固定液。4.保留值：试样各组分在色谱柱中滞留的时间或将组分带出色谱柱所需载气的体积。5.色谱峰：由检测器输出的电信号对时间作图，所得的曲线称色谱流出曲线，在曲线上隆起部分称色谱峰。6.峰面积：色谱峰与基线之间构成的面积。二知识点：1.分离原理：多种组分的混合样品进入色谱仪的气化室气化后呈气态，由于样品中各组分性质不同，在色谱柱中两项间的分配系数和吸附系数不同，在载气带动下各组分在柱子中运行速度也不同，根据出峰位置，确定组分的名称，根据峰面积确定浓度大小。2.气相色谱法的构造：载气系统；进样系统；分离系统，检测系统，记录系统。3.气相色谱法的用途：定量测定，定性检测。第十二章高效液相色谱法一知识点：1.根据分离机制的不同，高效液相色谱法的类型：液固吸附色谱；离子交换色谱；凝胶色谱；亲和色谱。第十三生物芯片一知识点：1.生物芯片的分类：（1）按制备方式：原位合成芯片，DNA微阵列（2）支持物不同：无机基因芯片，有机合成芯片（3）功能不同：基因表达芯片，DNA测序芯片2.基因芯片的应用：1基因测序；2基因表达量检测；3基因含量的检测；4基因突变的检测