脯氨酸含量的测定

脯氨酸含量的测定在逆境条件下,植物体内脯氨酸proline,Pro的含量显著增加;植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸;因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标;另外,由于脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程,因而能降低凝固点,有防止细胞脱水的作用;在低温条件下,植物组织中脯氨酸含量增加,可提高植物的抗寒性,因此,亦可作为抗寒育种的生理指标;一、原理当用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即为红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低;在520nm波长下比色,从标准曲线上查出或用回归方程计算脯氨酸的含量;二、材料、仪器设备及试剂一材料待测植物叶片二仪器设备1.722型分光光度计；2.研钵；小烧杯；4.容量瓶；5.大试管；6.普通试管；7.移液管；8.注射器；9.水浴锅；10.漏斗；11.漏斗架；12.滤纸；13.剪刀;三试剂1.酸性茚三酮溶液：将茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/l磷酸中,搅拌加热70℃溶解,贮于冰箱中;2.3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml;3.冰醋酸;4.甲苯;三、实验步骤1.标准曲线的绘制1在分析天平上精确称取25mg脯氨酸,倒入小烧杯中内,用少量蒸馏水溶解,然后倒入250ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,此标准液中每毫升含脯氨酸100ug;2系列脯氨酸浓度的配置：取6个50ml容量瓶,分别加入脯氨酸原液、、、、及,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,各瓶的脯氨酸浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml及6ug/ml;3取6支试管,分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30min;4冷却后各试管准确加入4ml甲苯,振荡30s,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液;5用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,于520nm波长处进行比色;6标准曲线的绘制：先求出吸光度值Y依脯氨酸浓度X而变的回归方程式,再按回归方程式绘制标准曲线,计算2ml测定液中脯氨酸的含量ug/2ml;2.样品的测定1脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各,分别置大管中,然后向各管分别加入3%的磺基水杨酸溶液5ml,在沸水浴中提取10min提取过程中要经常摇动,冷却后过滤于干净的试管中,滤液即为脯氨酸的提取液;2吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中,加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂,在沸水浴中加热30min,溶液即呈红色;3冷却后加入4ml甲苯,摇荡30s,静置片刻,取上层液至10ml离心管中,在3000r/min下离心5min;4用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯为空白对照,在分光光度计上520nm波长处比色,求得吸光度值;四、结果计算根据回归方程计算出或从标准曲线上查出2ml测定液中脯氨酸的含量X,ug/2ml,然后计算样品中脯氨酸含量的百分数;计算公式如下：单位鲜质量样品的脯氨酸含量%=X×VtW×Vs×106x100式中：X为从标准曲线查出的2ml测定液中脯氨酸的含量ug/2ml；Vt为提取液体积ml；Vs为测定时取用的样品体积ml；W为样品质量g;植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶NR,是植物氮素同化的关键酶,它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,NO3-＋NADH＋H+NRNO2-＋NAD+＋H2O;产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸或对-氨基苯磺酰胺α-萘胺或萘基乙烯二胺在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物;生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰,可用分光光度法测定;硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示;一般以ug氮/g·h为单位;NR的测定可分为活体法和离体法;活体法操作简单,适合快速、多组测定;离体法复杂,但重复性好;离体法一、材料、仪器设备及试剂一材料水稻、小麦叶片、幼穗等;二仪器设备1.冷冻离心机2.分光光度计3.天平感量4.冰箱5.恒温水浴6.研钵7.剪刀8.离心管9.具塞试管10.移液管11.吸尔球;三试剂1.亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO2溶于去离子水后定容至1000ml,然后再吸取5ml定容至1000ml,即为含亚硝态氮1ug/ml的标准液;2.l的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O与NaH2PO4·2H2O加去离子水溶解后定容至1000ml;3.1%质量浓度磺胺溶液：磺胺溶于100ml3mol/l盐酸中25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/lHCl;4.%质量浓度萘基乙烯胺溶液：萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中,贮于棕色瓶内;5.lKNO3溶液：KNO3溶于250mll的磷酸缓冲液;6.l的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O,K2HPO4·3H2O溶于1000ml去离子水中;7.提取缓冲液：半胱氨酸,EDTA溶于100mll的磷酸缓冲液中;8.2mg/mlNADH溶液：2mgNADH溶于1mll的磷酸缓冲液中临用前配制;二、实验步骤一标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂,配成0~的系列标准亚硝态氮溶液;摇匀后在25℃下保温30min,然后在540nm下比色测定;以亚硝态氮ug为横坐标X,吸光度值为纵坐标Y建立回归方程;配置标准溶液时各物质加入量试剂/ml管号1234567亚硝酸钠标准液0蒸馏水01%磺胺4444444%萘基乙烯胺4444444每管含亚硝态氮/ug0二样品中硝酸还原酶活力测定1.酶的提取：称取鲜样,剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min,取出置于冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液,研磨匀浆,转入离心管在4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液;2.酶的反应：取粗酶液于10ml试管中,加入lKNO3磷酸缓冲液和NADH溶液,混匀,在25℃水浴中保温30min,对照不加NADH溶液,而以l的磷酸缓冲液代替;3.终止反应和比色测定：保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应,再加1ml萘基乙烯胺溶液,显色15min后于4000r/min下离心15min,取上清液在540nm下比色测定;根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量ug;三、结果计算样品中硝酸还原酶活性ug/g▪h＝xVs×VTW×t其中：x为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量ug；VT为提取酶时加入的缓冲液体积ml；Vs为酶反应时取用的粗酶液体积ml；W为样品鲜质量g；t为反应时间h;根系活力的测定TTC法植物根系是活跃的吸收器官和合成器官,根的生长情况和活力水平直接影响地上部分的生长、营养状况及产量水平;一、原理氯化三苯基四氮唑TTC是标准氧化还原电位为80mV的氧化还原色素,溶于水中成为无色溶液,但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙;生成的三苯甲腙比较稳定,不会被空气中的氧自动氧化,所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体,植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强,而被丙二醛、碘乙酸所抑制;所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标;二、材料、设备仪器及试剂一材料水培或沙培小麦、玉米等植物根系;二仪器设备1.分光光度计2.分析天平感量3.电子顶载天平感量4.温箱5.研钵三角瓶7.漏斗量筒吸量管刻度试管11.试管架容量瓶13.药勺14.石英砂适量、1000ml烧杯;三试剂1.乙酸乙酯分析纯2.次硫酸钠Na2S2O4,分析纯,粉末;3.1%TTC溶液：准确称取,溶于少量水中,定容至100ml;用时稀释至所需要的各种浓度;4.磷酸缓冲液1/15mol/lpH7：准确称取磷酸二氢钾KH2PO4,加1mol/lNaOH溶液,并加水定容至1000ml或者1/15mol/l的磷酸氢二钠：称取Na2HPO4·12H2O蒸馏水定容至1000ml；1/15mol/l的磷酸二氢钾：称取分析纯KH2PO4,用纯水定容至1000ml;pH7的磷酸缓冲液即为取1/15mol/l的磷酸氢二钠12ml,1/15mol/l的磷酸二氢钾8ml,两者混合即可;5.1mol/l硫酸：用量筒取相对质量的浓硫酸55ml,边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000ml;三、实验步骤定量测定1TTC标准曲线的制作：取%TTC溶液放入10ml试管中,加少许Na2S2O4粉末摇匀后立即产生红色的甲腙;再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀;然后分别取此液、、、、置于10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含甲腙25ug、50ug、100ug、150ug、200ug的标准比色系列,以空白作参比,在485nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线;2称取根尖样品~,放入10ml烧杯中,加入%TTC溶液和磷酸缓冲液各5ml,把根充分浸没在溶液内,在37℃下暗保温1~3h,皆移入试管,最后加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在波长485nm下比色,以空白试验作参比,测出吸光度,查标准曲线,即可求出四氮唑还原量;四、结果计算单位质量鲜根的四氮唑还原强度mg/g▪h＝CW×t式中：C为从标准曲线查出的四氮唑还原量mg；W为样品重量g；t为反应时间h;