葡萄糖酸含量的测定方法

葡萄糖酸含量的测定高碘酸氧化法1测定原理葡萄糖酸经过高碘酸氧化后生成甲醛。CH2OH(CHOH)4COOH+4HIO4=HCHO+3HCOOH+CHOCOOH+H2O+4HIO3过剩的HIO4和生成的HIO3用NaHSO3溶液还原。4HIO3+14H2SO3——►4I+14H2SO4+2H2O2HIO3+5H2SO32I+5H2SO4+H2O最初游离出来的碘液将液体染色成黄色，继续滴加亚硫酸溶液，直至滴下一滴能够使液体明显(刚)褪色。生成的甲醛用乙酰丙酮比色法测定。在过量铵盐存在下，甲醛与乙酰丙酮生成黄色的二乙酰基二氢卢易司啶，根据颜色的深浅，比色定量，生成的颜色能稳定1Oh。2实验仪器可见分光光度计、旋涡混合器3试剂乙酰丙酮试剂：醋酸铵25g,冰醋酸3mL,新蒸馏的乙酰丙酮0.2mL,全部溶解于1OOmL水中。O.O2mol/L高碘酸溶液1g/L亚硫酸氢钠溶液5mmol/L的葡萄糖酸标准溶液。4操作步骤(1)标准曲线的绘制准确配制5mmol/L的葡萄糖酸钠标准溶液,按下表在各管中加样。表9：标准曲线绘制表试管号012345678910标准样/mL0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0高碘酸/mL0.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0在室温下任其反应2Omin。在旋涡混合器上充分混合并滴加NaHSO3至褐色刚褪。每管各加2mL乙酰丙酮试剂，定容至25mL。沸水浴中加热3min，冷却。在可见分光光度计420nm波长下测定OD值，用空白管溶液调零点，以葡萄糖酸浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。(2)样品中葡萄糖酸含量的测定精确称取样品0.1〜0.2g,加水溶解并定容至100mL。将样品溶液稀释适当倍数，吸取1.OmL样品稀释液加入试管中，再按绘制标准曲线的方法操作，以下各步相同，测得的OD值在标准曲线上查得相应的葡萄糖酸含量。5结果记录与计算葡萄糖酸的含量按下式计算：式中：W—样品中葡萄糖酸的含量，%m1一从标准曲线上查得的葡萄糖酸的含量，口gF—样品溶液的稀释倍数；m—样品质量，g100—配制的样品溶液的体积，mL10-6—将口g换算成g的系数。6注意事项（1）待测定的饮料等样品如含有乳酸、丙酮酸、柠檬酸、苹果酸和醋酸类它们将不会受到高碘酸的氧化作用而变成甲醛，因此对实验结果无影响。（2）生成的甲醛用乙酰丙酮比色测定，对少量的酮、醇及其它醛类不进行干扰测定。3.2异羟肟酸比色法用异羟肟酸比色法测定发酵液中葡萄糖酸含量。3.2.1测定原理葡萄糖酸在酸性条件下发生内酯化，形成的内酯与羟胺碱反应，生成异羟肟酸。异羟肟酸与FeCl3能生成有色络合物，从而可通过分光光度比色法定量葡萄糖酸的含量。3.2.2试验仪器可见分光光度计3.2.3试剂标准溶液：用葡萄糖酸钠配制0.100mol/L的标准溶液储备液。使用时根据需要稀释至不同浓度的标准葡萄糖酸溶液。盐酸羟胺与NaOH混合试剂:配制4mol/L盐酸羟胺溶液和4mol/L的NaOH溶液，低温保存。使用时，将等体积的盐酸羟胺和NaOH混合，混合后pH值为8.0。配制的溶液应在4h内使用。FeCl3试剂：FeCl3和HCl的混合溶液，其中FeCl3和HCl的浓度分别为0.37mol/L和0.1mol/L。3.2.4操作步骤样品测定：将样品溶液稀释一定倍数后，在10mL带有磨口塞的试管中各加入0.5mL标准溶液或者样品，再加入0.5mL去离子水，混合均匀后，沸水浴中加热20min，冷却至室温。然后顺序加入2mL盐酸羟胺和NaOH混合试剂、1mL4mol/LHC1和1mLFeCl3试剂，混合均匀，这时反应混合物的pH为1.2±0.2。放置10min后比色(波长505nm),以空白管(用0.5mL去离子水替代样品溶液，其余试剂用量与前相同)校零，读取各管的吸光度OD505值。测定工作在10min内完成。标准曲线绘制分别配制0、1、2、4、8mmol/L的葡萄糖酸钠溶液，按照前述的方法测定其吸光度(OD505)值，作出葡萄糖酸与OD505的标准曲线。表10：标准曲线的绘制表试管号01234葡萄糖酸钠标准溶液/mmol/L01248吸光度(od505)值3.2.5结果记录与计算葡萄糖酸的含量按下式计算：式中：c---样品溶液中葡萄糖酸的含量，mmol/L；C1---从标准曲线上查出的葡萄糖酸的含量，mmol/LF---样品溶液的稀释倍数。3.2.6注意事项由于发酵液里含有大量的葡萄糖，而且还有很多发酵产物，可能会影响测定。按照本测定方法的原理，不仅葡萄糖酸会内脂化，与羟氨碱、FeCl3反应，葡萄糖也会有类似反应。葡萄糖对葡萄糖酸的测定影响比较大，当葡萄糖酸浓度在0~8mmol/L范围内，同一葡萄糖浓度下OD505与葡萄糖酸浓度成直线关系。但是，葡萄糖酸浓度相同而葡萄糖浓度不同时，测定的od505有明显差异，特别是当葡萄糖酸浓度较低时，od505的差异更显著。