实验六 过氧化物酶活性测定

实验六过氧化物酶活性测定一、实验目的过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。二、实验原理在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收值，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。四、设备与试剂分光光度计，TDL-5000B型低速冷冻多管离心机（R=18cm），研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。0.05mol・L-1的磷酸缓冲液（pH5.5）,0.05mol・L-1愈创木酚溶液，2％H2O2。五、实验步骤（一）酶液的制备取1.0〜5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000Xg离心10min,上清液转入25mL容量瓶中。沉淀用5mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。（二）过氧化物酶活性测定酶活性测定的反应体系：依次加入2.9mL0.05mol・L-1磷酸缓冲液；1.0mL2%H2O2；1.0mL0.05mol・L-1愈创木酚和0.1mL酶液。用加热煮沸5min的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于34°C水浴中保温3min，然后迅速稀释1倍，470nm波长下比色，每隔1min记录1次吸光度A470，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位（U）。六、实验结果以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。△他沖xVt过氧化物酶活性（U•g1WXVsXO.oixtW——马铃薯鲜重（g）；t反应时间（min）；VT——提取酶液总体积（mL）；VS——测定时取用酶液体积（mL）。七、注意事项酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。实验七过氧化氢酶活性的测定一、实验目的过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。熟悉过氧化氢酶活性的不同测定方法。二、实验原理滴定法：过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢，即可求出消耗的H2O2的量。5H2O2+2KMnO4+4H2SO4—5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4氧电极法：过氧化氢在过氧化氢酶的作用下，放出氧气，其放氧量与过氧化氢酶的活性成正比。放出的氧可用氧电极定量测定。磷酸盐缓冲液（pH7.0）取磷酸二氢钾0.68g，加O.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml,用水稀释至100ml，即得。磷酸盐缓冲液（pH7.8）:取磷酸氢二钠35.9g，加水溶解，并稀释至500ml。已液：取磷酸氢二钠2.76g，加水溶解，并稀释至100ml。取甲液91.5，乙8.5混合得