细菌内毒素检测方法

细菌内毒素（译自英国药典BP2004版，等同欧洲药典EP5版。见原文之附录XIVA方法2.6.14.）本文所描述的五种方法用于检测产品中是否存在细菌内毒素，而这些方法适用于药典中的细菌内毒素的检查法--限度试验.方法的制定者希望弄清楚，如在生产中能否降低其产品中的内毒素的含量，本篇幅中有关使用这些测试的相关方法将在补充的附录被提供。细菌内毒素的检测原理是利用鲎变形细胞的溶解物来进行的（ＬＡＬ试验）。将含内毒素的溶液加入鲎变形细胞的溶解物可产生浑浊、沉淀或混合物的凝胶化反应。反应速度依赖于溶液中的内毒素的浓度、pH和温度；反应要求有一定量的二价阳离子、一个原凝酶系和可溶性蛋白的创造，而这些都哪由鲎变形细胞的溶解物提供。采用从染色基因肽中释放的染料浓度来进行测定样品的内毒素浓度。下面五种方法将在后面文章中介绍；方法A：凝胶法；限度试验方法B：半定量凝胶法方法C：动力学浑浊法方法D：动力学发色肽方法方法E：发色肽终点法当一篇专门文献中介绍内毒素的测定而没有指明某一种方法时，那么测试的方法就是按照方法A。次种方法已经得到证实，否则，产品的有效检测将会在专门文献中特别提到。很多专著以“细菌内毒素限定浓度”的概念给出了细菌内毒素指标，也即某种产品所含细菌内毒素浓度不能超过限定浓度，要想证明产品符合要求，就必须明产品所含内毒素的含量是少于内毒素限定浓度的。试验是利用一种能避免微生物污染的方式进行的。检测前的准备工作中，必须证实如下内容：1——所以的设备器皿不吸附内毒素。——溶解物的灵敏度λ，λ是被定义为标记的溶解物敏感度或者最低内毒素浓度被用于制作曲线的（定量法）。——干扰素的排除；如有必要时，需对设备和器具进行处理，以减少其本身所带内毒素。除非特别指明外，否则在文献中从方法A到E中均采用相同标准。在本篇附录中，术语说明中包括任何其他的容器，诸如一个微滴定率的极板等。本试验包括如下试剂和标准溶液制备：标准细菌内毒素BRP；与国际标准相比较，对标准内毒素BRP进行效准，并以国际标准单位来表示。鲎变形细胞溶解物：按标签所述浓度的原标准溶解物，对每一批来讲，都要按“溶解物敏感度”中所述来确定其固有敏感度。溶解物敏感度定义为在实验条件下能产生硬性凝胶时细菌内毒素的最低浓度，并以内毒素单位IU/ML来表示。LAL水：如果在规定的内毒素检测实验条件下，能给出一个阳性结果，那么这种水是合格的。利用一种能有效防止夹带水滴的装置将水蒸馏三次，就可得到合格的LAL水，也可以利用其它方法制备符合要求的水。0.1m的LAL与盐酸和0.1M的氢氧化钠溶液，用盐酸和氢氧化钠试剂均用LAL水来制备的，每种试剂都调制pH6.0~8.0时，在实验条件下能给出阴性结果为合格。除非有其它规定，实验所用溶液及稀释液皆须用LAL水来配置。凝胶法方法A和B都是使用在与溶液物混合后存在潜伏细菌内毒素的溶液中形成凝胶的形式，这两种方法要求溶解物敏感度在其影响被确定因素后测定的。方法A和B在是否包含比内毒素限定浓度更少的因素方面是不同的。方法A测试的是待测样品的复制溶液中所含内毒素比在有关指定专著中的内毒素限定2浓度少，而方法B中待检测样品中的内毒素含量被确定为半定量，而几何学平均内毒素浓度必须是少于被指定在专著中的内毒素限定浓度。在如下文章中，溶解物敏感度和干扰因素适用于方法A和方法B。步骤：取一定数量的器皿（如玻璃片或试管），在37±℃保温，分别加入适量溶解物，然后。按照一定的时间间隔（以能够读出各个结果为宜），依次向每一器皿中加入与溶解物相同量的待测溶液，并立即轻轻摇匀，不要震动，要避免蒸发水分，培养反应物至于一定的、已知适合条件的环境，时间（一般为20~60分钟），然后读取结果。如果混合物形成凝胶，并且器皿轻轻翻动时不破粹，则表明其结果为阳性；相反，如果混合物不形成凝胶，则表明其结果为阴性。溶解物的敏感度：至少准备标准细菌内毒素BRP的二倍稀释的四个重复系列浓度分别是2λ，λ，1∕2λ，1/4λ，此处的λ是所选用的固有溶解度，要求至少每一个的最后稀释液必须给出一阴性结果，依照步骤栏中所述，检测稀释液和由LAL水组成的阴性对照溶液，然后计算出每一系列中给出阴性结果的稀释液中所含细菌内毒素的最低浓度的对数值的平均值。这个平均值的反对数是溶解物敏感度的估计值。如果这个数值与固有敏感度相差不超过1/2倍稀释因子，则此固有敏感度便可以确定，并且有比溶解物进行的所有实验都采用这个值。干扰因素：溶液的pH必须在特定的溶解物的限定范围内，产品的范围通常在pH6.0~8.0，如有必要，用0.1mLAL盐酸，0.1mLAL氢氧化钠或者合适的缓冲溶液将待测液调至pH6.0~8.0。操作如“溶解物的敏感度”中所述，但准备标准内毒素ＢＲＰ的稀释液是采用待测制品中未经处理的样品，而这些样品中的内毒素是一检测不出来的。在最大的有效稀释度（ＭＶＤ）使用这些样品，比稀释度用下式计算：最大有效稀释度（ＭＶＤ）＝内毒素限定浓度/溶解物的敏感度着两个值都是以每ml所含细菌内毒素的国际单位来表示的。当细菌内毒素浓度是以每mg产品或每国际单位产品中所含内毒素国际单位数来表示的，此时将内毒素限定值乘以所检溶中的浓度（以mg/ml或所测产品的国际单位数/ml来表示）得到以每ml所测定溶液所含内毒素的国际单位数3表示内毒素限定浓度。上述相关方法，适用于组成与标签一致的产品浓度。出了欧洲药典之外的其它专著中，给定物质或待测样品的界限通常表达为细菌内毒素的限定浓度IU/ml（以给定物质或待测品的指定溶液），在这种情况下，以上的计算就没有必要。在含有待测制品情况下测得敏感度值，如果与在不含有待测制品的情况下测得的敏感度值相差不大于1/2倍稀释因子，那么就可以认定待测品不含有不干扰实验条件的因素，可以不进行进一步处理而检测；反之，待测品就有抑制剂或激活剂的作用。添加能够置换出被吸收细菌内毒素的物质，选用一个较敏感的溶解物可使得待测制品的最大有效稀释倍数增大，以利于排除干扰。如果待测制品的稀释低于最大有效稀释度而不能通过实验，则用最大有效稀释度重复测试。当干扰物能通过截流相对分子量为10000到20000的膜过滤器中，就可以选用超滤的方法进行处理，可以使用三乙酸纤维素不对称膜过滤器，但使用前必须进行检查，因为它可能含有导至假的阳性反应实验的成分，截流在膜上的物质中含有细菌内毒素，用LAL水或适当的缓冲洗液使细菌内毒素重新溶于LAL水或者缓冲溶液中，对每一个待测样品的起始检测体积和处理后内毒素溶液的体积需要定量。为了确定所选的处理方法能有效消除干扰，同时又不损失内毒素，可以将标准内毒素BRP加入待测样品，并以同样的方法处理，重复干扰因素实验。方法A：凝胶（限度法）待检测样品中的内毒素；用待检测样品（如有必要，可对其进行减少干扰因素的处理）的最大的有效稀释，依步骤栏中所述，进行两次平行样对照，同时检测一个由LAL水组成的阴性对照和两个阳性对照，对这两个阳性对照都含二倍溶解物固有敏感物浓度的标准内毒素BRP，其中一个还含有实验所用浓度的待检样品（加入标准内毒素后，如有必要，可以对其进行处理以减少干扰）。如果阴性对照和两个阳性对照，能全部给出适当的结果，则此次实验有效。4如果两次平行实验混合物都给出阴性结果，则此待测样品合格；如果两次平行实验混合物给出阳性结果，则对测样品不合格；如果一次为阳性结果、一次为阴性结果，则必须重复实验。只有两次混合物都给出印象结果，才能判定待测样品合格。方法B：半定量凝胶法待测样品中的内毒素：如有必要，可对待测样品进行减少干扰因素的处理，准备下列溶液：（a）准备用作测试干扰因素的待测样品的两种独立重复溶液，使用BET水配制两组独立溶液的四个重复系列，浓度分别为1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍，对已准备好的用作测试干扰因素的溶液进行相应的稀释。（b）（b）准备标准内毒素BEP的二倍稀释液的四个重复系列，浓度分别是2λ、λ1/2λ、1/4λ。（c）用作测试干扰因素的待测样品的两个独立重复稀释液和浓度为2λ的标准内毒素BRP。（d）BET水（指阴性结果的），按以下所描述的溶解物的敏感度来进行定量，如果满足以下三个条件，测试是有效的。按以下所述的溶解无的敏感度来进行定量分析，如果满足以下三个条件，测试是有效的。——所获得的溶液d的结果是阴性的；——所获得溶液c的结果是阳性的；——所获得溶液b的内毒素浓度几何平均值在1/2λ到2λ范围内》假定每一系列样品的最低浓度给出是阳性的，则包含溶解物的敏感度（内毒素单位IU/ml0。如果样品的原始溶液被干扰因素d1稀释至完成干扰因素测试，而这种溶液被干扰因素d2进一步稀释导致出一种阳性结果的最低浓度，产品（λd1d2）效价每ml待检样品的原始溶液的内毒素的IU数量。计算两系列的两效假的几何平均值，如果平均内毒素浓度是小于指定在5有关专著中的内毒素限定浓度，则通过测试试验。动力学方法动力学混浊（方法C）和动力学发色肽方法(方法D)都是利用内毒素浓度的对数上的反对数的线性衰退测试的。这种方法的技巧在过程中每一方法将单独地分别被描述；在标准曲线的标准段上，影响因素和待检样品中的内毒素浓度将运用于动力学浑浊方法和动力学发色肽检测。方法C——动力学浑浊方法步骤：使用一个合适的仪器，测量溶解物已被增加的溶液的浑浊度达到预定发展程度所许的反应时间，溶液内毒素浓度可能借助于一种标准曲线，以反应时间的对数作为横坐标的标准曲线来测定。线性部分的衰退曲线中的浑浊度的变化率可能被用来测定细菌内毒素的浓度。方法D动力学发色肽方法步骤：在适当的波长下，使用一分光光度计，测定在含内毒素溶解物的浑合溶液中，发色肽释放染料达到预定强度的颜色所需要的时间，溶液内毒素的浓度可能有助于反应时间的对数作为横坐标的标准曲线来测定的。方法C和方法D标准曲线标准性的确定；当使用一批新的溶解物或当影响测试结果的任何其它条件改变时，就要对标准曲线的标准进行确认。准备至少两个独立系列的标准内毒素BRP浓度，浓度要在标示的范围内，不要超出厂家建议的范围以外。每个单位至少一个浓度，这个浓度在对数范围内和BRP水的阴性控制区间内，每一个试管中加入等量的溶解物，在方法D中，加入相同的基因肽，按照上述的方法，测定准确时间。对每一个试管，作出内毒素浓度的对数关系图，这个对数关系是在标准分析方法下，基于细菌内毒素的对数和反对数时间作出的。衰退曲线必须有显著的坡度和线性关系，而且显著的线先关系的95%和工厂提供的浓度是对应的。6用等值浓度对数的点来检查衰退曲线线性关系是否成比例关系，如果有三个点的（λ1λ2λ3），就用第二个浓度λ2作为λm来作干扰因素和待检样品的内毒素的测验；如果是4个点或5个点，则用第三个浓度作为λm。除了这个要求以外，由制造商提供的溶解物的其它测试或特别要求必须也同时满足。干扰因素：准备四个含有标准内毒素BRP的独立重复溶液，浓度为λm，待检样品的稀释因素用下列方式计算：内毒素限定浓度/λm溶液的pH必须在特定的溶解物的限定范围内，产品的范围通常在pH6.0~8.0之间。如果必要，用0.1mLAL氢氧化钠或合适的缓冲液将待测液调至pH6.0~8.0。对这份溶液进行分析，计算平均内毒素浓度的对数值、反对数值。如果平均内毒素浓度至少是λm的50%待检延聘中不含有影响测试条件下溶解物活性的因素，不需要作干扰因素的排除工作就可进行测试。如果平均内毒素浓度小于λm的50%干扰因素按方法A中所述进行排除。当平均内毒素浓度超过衰退曲线的最高值时，用最高浓度重复后测试，计算方法如下：内毒素限定浓度/λmˊ注：λmˊ要满足λ1＜λmˊ＜λm。待测样品的内毒素：如有必要，可对其进行干扰因素处理，溶液的pH必须在特定的溶解物限度范围内，产品的范围通常在pH6.0~8.0，如有必要，用0.1mLAL盐酸，0.1m氢氧化钠或者合适的缓冲液将待测物调至pH6.0~8.0。准备下列溶液：7（a）两份待测样品的独立重复溶液，用来测试干扰因素；（b）两个含有标准内毒素BRP的独立重复溶液，浓度分别为λ或λ，在（a）下稀释待检样品；mmˊ（c）三个标准内毒素BRP浓度对数关系的大呢感值浓度，在衰退曲线的线性范围内，重复测试每一个溶液；（d）BET水（指阴性结果的），按照“标准曲线确认的方法”中描述的方法进行分析，使用控制关系（c）产生的衰退曲线，计算出每一个溶液（a）和（b）的内毒素的浓度。如果下面三个条件符合，则测试是有效的。——阳性结果（d）没有超过空白值范围，这个值可从溶解物敏感度得到。——阴性结果（C）符合有效值的要求，这个有效值是在控制标准曲线的标准段上描述的。——内毒素的回收，减去溶液（a）的几何平均内毒素后，计算得到的溶液（b）的几何平均内读司浓度大于50%且小于200%，通过λm或λmˊ划分减去的结果来计算回收的百分数，然后将此结果乘以100。当两种溶液（a）中的一种其内毒素浓度小于λm或λmˊ，则待测样品通过测试（IU/ml）。如果两种溶液中的一种内毒素浓度低于限度，而另一种高于限度，则应重新测试；如果两种溶液符合限定值，则测试结果有效。方法E发色肽终点法步骤：测定在含有内毒素的溶液中，从适当的染色基因肽中释放的染料浓度，在一定的波长下，使用一分光光度极。在先定的波长下，根据标准曲线选择，溶液内毒素是浓度被吸收而分开，就像标准曲线标准性确认中所述的。标准曲线标准性确认：当使用一批新的溶解物或当影响物的任何其他条件改变时，就要对标准曲线标准性进行确认。8标准至少有两个独立系列的四个标准内毒素BRP的浓度，浓度要延伸至溶解物制造商所指定的范围，这个范围必须包含制造商指定的限定λ，使用一个空白实验须根据溶解物制造商的说明。向每一组试管中加入等量的溶解物和染色基因肽，放置制造赏指定的时间，停止反应，在指定的波长下，测定吸光度。对每一只试管，画出四种重复系列的每一种浓度的曲线，作为细菌内毒素浓度的函数，使用标准分析方法，对浓度的吸光度进行回归分析。回归线必须有显著的倾斜和明显的线段部分，而且显著的线性关系的95%和厂家供应的是相对应的。确定内毒素浓度λm，λm是回归线的线段部分内毒素浓度的最大值λh和最小值λi的算术平均值，所有的值以内毒素IU/ml表示。除了这些要求由制造商提供的溶解物的其他测试或特别要求外。干扰因素：准备四个含有标准内毒素BRP的独立重复溶液浓度为λm，待检样品的稀释因素用下式计算：内毒素限定浓度/λm溶液的pH必须在特定的溶解物的限定范围内，产品的范围通常在pH6.0~8.0，如有必要，用0.1mLAL盐酸、0.1mLAL氢氧化钠或者合适的缓冲溶液将待测液调至pH6.0~8.0。对这四份溶解液进行分析，计算内毒素浓度的平均值。如果平均内毒素浓度至少加入λm的50%而小于200%的λm，待测样品中不含有影响测试条件溶解物的因素，故不需要作干扰素的排除就可以进行测试。如果平均内毒素浓度小于50%的λm或者大于200%的λm，按照方法A中所规定的排除干扰因素。当平均内毒素浓度超出回归曲线的线段部分的最高值时，用最高浓度重复实验，用下式计算：内毒素限定浓度/λmˊ9注：要求满足条件λ1＜λmˊ＜λm敦检样品的内毒素：如有必要，可对其进行干扰因素的处理，溶液的pH必须在特定溶解物限定范围内，产品的范围通常在pH6.0~8.0，需要时用0.1m演算、0.1m氢氧化钠或合适的缓冲溶液将待测液调至pH6.0~8.0。准备下列溶液：（a）两份待测样品的独立重复溶液，用来测试干扰素；（b）两个有标准内毒素BRP独立重复溶液，浓度为λ或λ在mmˊ，（a）中稀释待测样品；（c）两份含有标准内毒素BRP重复溶液，高浓度为λh，低浓度溶液为λi。（d）BET水（指阴性结果），按照“标准曲线的标准性确认”中描述的方法进行分析，确定在每一种溶液（a）（b）（c）（d）潜伏后的吸收，利用溶液（c）和（d）的吸收计算回归线和溶液（a）和（b）的内毒素浓度。如果下列条件满足，则测试有效：——阴性结果（d）没有超过（b）值的范围，这个值从溶解物的敏感度得到的；——阴性结果（c）符合准线要求，用来核对溶解物的敏感度；——内毒素的吸收减去溶液（a）内毒素的算术平均值后，计算得到的溶液（b）内毒素算术平均值是大于50%且小于200%，通过λm或λm划分减去的结果来计算的百分数，然后将结果乘以100即得。如果两种溶液（a）的任何一种的内毒素浓度小于内毒素IU/ml的λmˊ，待检样品通过测试；如果两种溶液的内毒素浓度高于限定值，一种低于限定值，则需要重新实验；如果两种溶液（a）都满足限定值，则待册样品通过测试实验。黄石兴华生化有限公司童琨、冯家骏译校1011