消支饮治疗小鼠生殖道解脲支原体感染对血清干扰素

 

     解脲支原体(Uu) 是介于细菌与病毒之间的最小原核微生物, 属于柔膜体纲、支原体科、脲原体属的微生物。重要寄生在人类泌尿生殖道黏膜外

, 女性生殖道感染后可上行至子宫腔和输卵管腔引起相应部位的炎症。针对其病因病机导师梁学林教授制订了以健脾益气, 升阳除湿为主, 佐以清热解毒杀虫的治疗大法, 自拟 消支饮 方治疗本病, 重视扶正祛邪, 固护正气, 尤其对抗生素治疗耐药的患者更为适宜。通过动物实验以中药 消支饮 方, 治疗Uu 感染, 并设西药 阿奇霉素 为对照组, 从小鼠Uu 转阴率、血清干扰素- 两方面观察 消支饮 的治疗作用。
    1 材料与试剂
    1. 1 实验动物 BALB/C 小鼠104 只购于中国医学科学院实验动物研究所, 鼠龄8 周, 雌性, 清洁级, 体重(20 2)g。
    1. 2 实验药品及制备 消支饮：由太子参、山药、柴胡、炙甘草、陈皮、白芍、炒荆芥、车前子、苍术、炒白术、黄柏、苦参等中草药构成, 由辽宁中医药大学附属医院中药局制备,浓缩至2 g/ml( 即1 ml 煎液内含有2 g 生药), 灭菌备用。
    阿奇霉素：石家庄欧意药业 生产, 规格：0.25 g/片,生产批号：国药准字H10980218。
    1. 3 重要试剂 Uu 株：Uu 血清8 型冻干标准株, 由南华大学微生物教研室提供。复苏并传代后备用。
    液体培养基：购于珠海丽珠试剂 , 批号：YZB/粤0205-2007。
    固体培养基：购于上海恩康生物科技 , 批号：YZB/ 沪0948-40-2005。
    小鼠IFN- 定量酶联试剂盒：购于ADLITTERAMDIAGNOSTIC LABORATORIES, 批号：QRCT-301330101003-EIA/UTL。
    1. 4 重要仪器及设备 酶联免疫吸收仪, 型号Anthos-2010, 用于测定血清IFN- ;日本奥林巴斯BX51 号显微镜,用于小鼠阴道分泌物Uu 检测观察。
    2 实验
    2. 1 Uu 菌液制备 将冻于-80℃的Uu 血清8 型标准株置37~45℃水浴中1 min, 使其快速融化, 无菌接种于Uu 液体培养基, 37℃恒温箱培养24~48 h, 见液体培养基由黄变红, 且液体澄清透亮无浑浊、沉淀, 可确认有Uu 生长。取对数生长期Uu 菌液制成2.5 105 ccu/ml 浓度, 经1000 r/min 4℃离心集菌备用。
    2. 2 动物造模 在同样条件下, 随机分为A、B、C、D、E、F、G 7 组。模仿Taylor-Robinson 的造模方法, A、B、C、D、E、F 组每只小鼠颈部皮下打针苯甲酸雌二醇0.4 mg, 浓度1mg/ml, 每周1 次, 共4 次。A、B、C、D、E、F 组小鼠在经过雌激素预处理后, 将血清8 型浓度为2.5 105 cuu/ml 的Uu菌液用留滞针软管取20 l 注入小鼠阴道, 连续给菌3 d。小鼠在接种Uu 1 周后取小鼠阴道分泌物进行检测。用2 支无菌棉签棒伸入小鼠阴道0.5 cm 悄悄迁移转变, 将第1 支棉签在液体培养基(1 ml) 中充足洗脱, 进行液体培养;第2 支棉签接种于Uu 固体培养基平板上。固体和液体培养基均放于37℃孵育箱孵育, 24~48 h 后观察结果, 液体培养基颜色由黄变红且澄清, 固体培养基长出典型 煎蛋样 Uu 菌落, 提示造模成功。
    2. 3 分组给药治疗 消支饮预防高剂量组(A 组：14 只小鼠,造模同时, 给予中药 消支饮 80 g/(kg d), 连续给药4 周;消支饮预防低剂量组(B 组) ：14 只小鼠, 造模同时, 给予中药 消支饮 20 g/(kg d), 连续给药4 周;消支饮治疗高剂量组(C 组)：17 只小鼠, 造模成功后, 给予中药 消支饮 80g/(kg d), 连续给药3 周;消支饮治疗低剂量组(D 组) ：17只小鼠, 造模成功后, 给予中药 消支饮 20 g/(kg d), 连续给药3 周;阿奇霉素组(E 组) ：14 只小鼠, 造模成功后,给予西药 阿奇霉素 0.2 g/(kg d), 连续给药2 周;模型组(F组) ：16 只小鼠, 造模成功后, 给予0.9% 的生理盐水, 连续3 周;空白组(G 组) ：12 只小鼠, 正常饲养, 与模型组同时给予0.9% 的生理盐水, 连续3 周;灌胃量：每10 g 小鼠给0.4ml 的药液, 天天给药1 次。
    2. 4 实验检测指标 小鼠转阴率的检测：实验给药结束后,全部小鼠取阴道分泌物进行检测。24~48 h 后观察结果。于奥林巴斯BX51 号显微镜下观察并拍照。
    小鼠血清中IFN- 值检测：用消毒眼科镊取出小鼠眼球, 取小鼠眼球血, 应用酶联免疫吸收分析仪检测血清IFN- 值。
    2. 5 统计学方法 采取SPSS17.0 统计学软件对数据进行统计分析。计数资料采取率(%) 表示, 行 2 检验;计量资料应用LSD-t 检验。P 0.05 表示差别具有统计学意义。
    3 结果
    小鼠在接种Uu 1 周后取小鼠阴道分泌物进行检测。液体及固体培养基检测结果显示：A、B、C、D、E、F 组小鼠均感染了Uu, 感染率100%, 空白组12 只小鼠均未感染Uu,感染率0。证明实验造模成功。
    3. 1 治疗后Uu 转阴率
    3. 2 血清IFN- 检测 取小鼠眼球血, 离心分离出血清,采取酶联免疫吸附法, 由酶联免疫吸收分析仪读取结果, 换算出最后IFN- 值。基本步骤①取出酶标板, 按照顺序对应分别参加100 l 的标准品于空白微孔中;②分别标记样品编号, 参加100 l 样品于空白微孔中;③在标准品孔和样品孔中参加50 l 的酶标记溶液;④ (36 2)℃孵育反应60min ;⑤洗板机清洗5 次, 每次静置10~20 s ;⑥每孔参加底物A、B 液( 呈色剂) 各50 ⑦ (36 2)℃下避光孵育反应15 min ;⑧每孔参加50 l 终止液, 终止反应。
    结果判定：于波长450 nm 的酶标仪上读取各孔的OD 值;B= 标准品OD 值、B0= 标准品0 点OD 值;以B/B0% 值为纵坐标, 以标准品的浓度为横坐标, 在对数坐标纸上绘制标准曲线;在标准曲线上查找对应的浓度范围;敏感度为1.0pg/ml, 根据样品OD 值在该曲线图上查出相应小鼠IFN- 含量。
    4 讨论
    4. 1 本实验研究的结果分析
    4. 1. 1 治疗后转阴率分析 各组小鼠治疗4 周后对小鼠分泌物Uu 检测结果说明, 消支饮和阿奇霉素对Uu 感染均有治疗作用。本实验属于急性Uu 感染, 根据转阴率能够说明, 阿奇霉素对急性Uu 感染的抑菌作用优于消支饮, 且消支饮高剂量组疗效优于低剂量组。
    4. 1. 2 干扰素- 值分析 国内外专家研究发现Uu 发病与免疫因素有关, 其中IFN- 由活化的T 细胞产生, 是迟发型超敏反应(DHSR) 中最主要的细胞因子, 多位学者以为, 在Uu感染致病经过中与输卵管损伤有关。Shcheglovitova 等发现Uu 感染妇女血清IFN- 水平升高。袁淑珍通过研究发现输卵管支原体感染不孕妇女输卵管液中IFN- 水平升高,以为支原体感染引起的输卵管炎症导致不孕可能与IFN- 升高有关。IFN- 作为免疫细胞因子, 在正常情况下, 对机体有保卫作用