蛋白洗脱说明书

B-PERGST融合蛋白纯化试剂盒试剂：B-PER细菌蛋白质提取试剂固定用的谷胱甘肽柱子Washbuffer1Washbuffer2Reducedglu保存于四度介绍：B-PERGST融合蛋白纯化试剂盒可以有效纯化融合了GST标签的重组蛋白，这种重组蛋白表达于细菌中或是baculovirus-infectinsectcells..蛋白质首先由“B-PER细菌蛋白质提取试剂”提取。然后，GST融合蛋白通过包被了固定化的谷胱甘肽的柱子，而被纯化。B-PER试剂可以有效地溶解细胞，从而提取可溶的重组蛋白质于BUFFER中，并且最大量最特异的绑定GST融合蛋白到谷胱甘肽柱子上。洗脱了其他非绑定蛋白后，GST融合蛋白才会被洗脱，存在于含有reducedglu的buffer中。250ml的过夜的细菌培养物中可以纯化得到10ngGST融合蛋白。重要信息：为了得到最好的结果。首先进行一个小规模的提取实验来估计表达水平和GST标签蛋白的溶解度：根据实验表达蛋白，用适当B-PER试剂溶解细胞，离心得到上清进行SDS-PAGE。只有澄清无颗粒的可溶性蛋白提取物才能成功通过亲和柱。通常，以包涵体形式表达的蛋白不能通过B-PER试剂溶解，虽然这试剂可以有效地把包涵体从其它细胞组份中纯化出来，从而通过变性剂来溶解包涵体。（B-PER试剂说明书，NO.78248,可从网上得到）通过尿素或胍基溶解的GST融合蛋白包涵体，必须通过透析除去变性剂和重新折叠蛋白，只有这样这种亲和方法才能用来进行纯化（GST必须具有功能性才能绑定谷胱甘肽）谷胱甘肽-GST绑定是一种特异性很高的反应，通过Washbuffer1和Washbuffer2尽量减少了非特异性绑定。如果有非特异性绑定发生，那么可以考虑增加Washbuffer的盐浓度或是稍微改变PH.。GST蛋白纯化步骤：使柱子和buffer到室温250ml细菌培养物（OD6OO=1.5-3.O）离心去除上清得到细胞颗粒，若用的冷冻细菌则溶解至四度再开始提取蛋白通过涡流或是移液器上下吹打，用10mlB-PER试剂悬浮细胞，直至悬浮均匀，室温轻柔的摇晃混合物10min27000*g（14000rpm）离心15min，得到可溶性蛋白，除去不可溶蛋白与细胞碎片。注意：如果提取物太过粘稠可以加入DNAse1来消化过量的DNA.o（这种粘稠就是由于过量的DNA存在而导致的）转移上请（蛋白提取物）到新管。注意：通常大于99%的可溶性蛋白存在于此上清中。如果有需要，可以用额外的B-PER试剂进行第二次蛋白提取从而得到剩下的蛋白。打开顶盖，拧开底部（如果要重新盖住柱子就用附件中有的白色尖状物作为底盖），轻轻倒出叠氮化钠溶液或让其从柱子中自动流干净。7.加入10mlB-PER试剂作为树脂床，并让它流过柱子8.用10ml样品到柱子中并让它流过树脂床。注意：可以在这一步中以及第9第10步中收集流过的部分，从而通过SDSPAGE方法，绑定和洗脱的效果。加入最少6mlWashbuffer1来清洗柱子并让它流过树脂床加入最少3mlWashbuffer2来清洗柱子并让它流过树脂床加入12mlWashbuffer2到一个含有184mgReducedglu小瓶中，从而做成洗脱缓冲液。加入12ml洗脱缓冲液，收集出现的部分。拖过测量280nm出的吸光度来监视洗脱过程。大约95%的GST融合蛋白存在于前两个3ml中。通过SDSPAGE来检测洗脱蛋白。应用凝胶过滤法或是透析法（buffer-exchang）来除去多余的谷胱甘肽。注意：一个柱子可以用至少三次并且不会失去主要的绑定能力。当蛋白完全洗脱完后，用2-5ml的Washbuffer1来清洗树脂床。当溶液仍在树脂床上时，盖上盖子柱子放于4度。用含有0.01-0.02%叠氮化钠Washbuffer1来防止长期储存时发生的微生物污染。用特定的柱子来做特定的重组蛋白样品来防止样品交叉污染。可能出现的问题及解决方法：蛋白产量低：1.可溶蛋白表达量少优化蛋白表达条件融合蛋白形成包涵体改变培养条件来减少包涵体的形成并最大量的表达可溶蛋白；诱导后在生长早期阶段收集细胞或是降低温度（用30度代替37度）；用变性剂溶解包涵体（包涵体溶解试剂产品NO.78115）然后通过透析来还原蛋白。细胞裂解不充分提取不充分用推荐量的B-PER试剂or\and提取之前冷冻细胞融合蛋白不绑定到柱子上检查GST融合蛋白是否存在，能否绑定；incude5MmDTTintheBPERreagentforlysisstep（在裂解步骤中的BPER试剂中加入5MmDTT）蛋白纯度低：柱子洗脱不充分用Washbuffer1来增加额外次数的清洗柱子融合蛋白与细菌其他蛋白反应在裂解步骤中的BPER试剂中加入5MmDTT柱子流速低1柱子超载放少量的蛋白提取液到柱子上，或是确保提取液中没有充满颗粒，或是提取液过粘。