冷冻干燥

.一、冷冻干燥技术原理冷冻干燥即通常所说的冻干，是将含有大量水分的生物活性物质先行降温冻结成固体，再在真空和适当加温条件下使固体水分子直接升华成水汽抽出，最后使生物活性物质形成疏松、多孔样固状物。冷冻于燥技术的特点是：整个冻干过程在低温真空条件下进行，能有效地保护热敏性物质的生物活性，如酶、微生物、激素等经冻干后生物活性仍能得到保留；能有效地降低氧分子对酶、微生物等的作用，保持物质原来的性状；干燥物呈海绵状结构，体积几乎不变，加水后迅速溶解，并恢复原来状态；干燥能排除95%以上的水分，使干燥后的产品能长期保存而不致变质。二、冷冻干燥技术方法（一）冻干设备与装置物质的冻干在冷冻真空干燥系统中进行。冷冻真空干燥系统由致冷系统、真空系统、加热系统和控制系统四个部分组成。1.致冷系统由冷冻机、冻干箱和冷凝器内部的管道组成。其功用是对冻干箱和冷凝器进行致冷，以产生和维持冻干过程中的低温条件。2.真空系统由真空泵、冻干箱、冷凝器及真空管道和阀门组成。真空泵为该系统重要的动力部件，必须具有高度的密封性能，使制品达到良好的升华效果。3.加热系统常利用电加热装置。加热系统可使冻干箱加热，使物质中的水分不断升华而干燥。4.控制系统由各种控制开关、指示和记录仪表、自动控制元件等组成。其功用是对冻干设备进行手动或自动控制，使其正常运行，保证冻干制品的质量。（二）冻干程序1.测量共熔点生物制品在冻干前多配成溶液或混悬液，溶液随温度降低而发生凝固冻结，达到全部凝固冻结的温度称为凝固点或称共晶点。不同物质的凝固点不同。实质上物质的凝固点也就是该物质的熔化点，故又称该温度为共熔点，准备冻干的产品在升华前，必须达到共熔点以下的温度，否则则严重影响产品质量。不同生物制品的共熔点不同，生物制品的共熔点依其组成成分不同而异，必须测定每种生物制品的共熔点才有可能按此共熔点进行冻干。测定共熔点的原理是根据导电溶液的电阻与温度相关，当温度降低时电阻加大，当降到共熔点时电阻突然增大，此时的温度即为该溶液物质的共熔点。正规测定法是将一对白金丝电极插入液态制品中，并插入一支热电阻温度计，并将电极、温度计、仪表与记录仪连接，然后将溶液物质冷冻至一40℃以下低温，直到电阻无穷大，随后缓慢升温至电阻突然降低的温度即为该溶液物质的共熔点。表3-1一些物质的共熔点（℃）物质共熔点0.85%氯化钠溶液-2210%蔗糖溶液-2640%蔗糖溶液-3310%葡萄糖溶液-272%明胶、10%葡萄糖溶液-322%明胶、10%蔗糖溶液-1910%明胶、10%葡萄糖、0.85%氯化钠溶液-36脱脂牛乳-26马血清-352.预冻冷冻干燥之前，先将溶液物质在低温（一40℃以下）下冻结称为预冻。其方法有冻干箱内预冻和冻干箱外预冻两种。将溶液物质分装于小瓶、安瓿等小容器，置冻干箱的...分层搁板上后密闭，在一40℃以下进行预冻，称为箱内预冻；如分装后置一40℃以下低温冰箱冻结后再移入冻干箱内进行冻干的称箱外预冻。此外，如大装量的血浆制剂等则在箱外采用旋转冻结法预冻后再移入冻干箱内冻干。预冻对冻干制品的质量至关重要。影响预冻效果的因素有以下几个方面：（1）溶液物质的组分与浓度生物制品通常由水、生物活性物质（微生物、酶、蛋白质等）和保护剂（高分子物质、低分子物质等）组成，其中水以外的物质应含有一定比例才能保持冻干后的干物质具有一定的理化学性状，通常在4%~25%。（2）装量物质在冻干时，容器的表面积与物质厚度比是一定的，亦即冻干与装量有关。表面积大，厚度小有利于水分子升华，冻干容易而质量理想。通常装量为容器容量的1/5~1/4，厚度不超过10mm。（3）预冻速度溶液物质在冻结过程中由于机械效应和溶质效应而对细胞的活性有一定破坏作用，因此，每种物质都有不同的最低预冻温度、最短预冻时间和最佳预冻速度。此三项数值可根据不同物质的共熔点、冻干机性能通过实验获得。生物制品一般预冻时间为3~4h即可开始升华。3.干燥制品干燥过程分两个阶段。（1）升华干燥阶段在共熔点温度将冻结物质中的水分除去的过程称为升华。冻结物质的共熔点温度亦即其升华温度，因此，必须对冻结物质加热，但温度不能超过其共熔点温度。而低于共熔点温度过多，则升华速率降低，升华时间延长。升华的进行取决于制品升华表面与冷凝器冷霜表面之间水蒸气的压力差，冻干箱内的压强一般为10~30Pa时，冻结物质容易获得热量，升华速度增加，压强超过30Pa时，产品吸收热量减少，升华速度减慢，发生融化。升华干燥时间的长短与制品的共熔点、装量厚度、供热量等因素相关，经升华可除去90%以上的水分。（2）解析干燥阶段使与物质结合的水分子通过加热方式除去的过程称为解析干燥。通常在加热下迅速使物质温度上升到25~30℃，冻干箱内的压强控制在15~30Pa下进行解析干燥。解析干燥的时间与物质品种有关，耐热物质解析干燥时间短；与残水量要求有关，对残水量要求越低的产品，解析干燥时间越长；与冻干机组的性能有关。4.冻干的后处理冻干程序结束后，冻干箱仍处于真空状态，放入无菌干燥空气或氮气后才能打开箱门，取出制品。干燥制品一旦暴露在空气中，即迅速吸收空气中的水分而潮解，并增高制品的含水量，或因氧气侵人而引起不可逆的氧化作用。因此，必须迅速加塞和压盖。干燥制品的加塞有箱内加塞法和箱外加塞法两种。（1）箱内加塞法是根本防止干燥制品受空气中水分和氧气影响的方法。采用有特殊装置的冻干箱和特制的瓶与塞相配合，冻干箱配有液压或气压压塞的动力装置；具有四脚的丁醛胶塞安置在冻干瓶口上，在真空或放入惰性气体下进行自动压塞。箱内加塞须注意：①由于冻干瓶口上有四脚胶塞，从而增加了水气溢出阻力，因此，需相应调整冻干曲线，加热要适当减慢，时间要适当延长；②冻干箱内各板层的冻干瓶要安排均匀，缺少部分要用同样的带塞空瓶补足，以保证压力均等；③压塞力不易过大，由于箱内板层是串联的，即一层的压力即为全箱的压塞总力，每一层的力就是每一瓶所需的力乘以该层上放置的瓶数。例如：每瓶压塞需力为5kg，每一板层放置1000瓶，则压塞的力为：5kg×1000=5000kg。2）箱外压塞法在冻干结束后，即放入无菌干燥空气或氮气，开启冻干箱门，迅速加塞，抽真空，封蜡，或加塞、压盖铝帽再抽空。如制品数量多而封口时间过长时，则可分批出箱或转移到另一干燥箱内后分批进行封口。三、冻于保护剂...冻干保护剂又称稳定剂或分散剂，是指在冻干过程中及其后使生物制品的活性物质免受破坏的一类物质。（一）保护剂的组成与功能生物制品冻干保护剂通常由三类物质组成，并由此三类物质组合成适用于各种生物制品的各种类型的冻干保护剂。1.低分子物质包括糖类和氨基酸类。低分子物质可产生均匀的混悬液，使微生物保持稳定的存活状态及对水分子起缓解作用；并能使冻干生物制品仍含有一定量水分；还可促进高分子物质形成骨架，使冻于制品呈多孔的海绵状，从而增加溶解度。2.高分子物质范围很广，种类甚多。高分子物质在冻干生物制品中主要起骨架作用，防止低分子物质的碳化和氧化；保护活性物质不受加热的影响；使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，从而使溶解度增加。3.抗氧化剂包括一些有机的和无机的物质。抗氧化剂具有抑制冻干制品中的酶作用，从而促进、保持微生物等活性物质的稳定性。（二）常用的冻干保护剂各类微生物适用的保护剂很多，不同国家的配制方法也不相同。即使同一种制品使用的保护剂组成也不一样，例如：鸡新城疫弱毒疫苗，我国选用5%蔗糖脱脂乳为冻干保护剂，而日本则用5%乳糖、0.15%聚乙烯吡咯烷酮、1%马血清或0.4%蔗糖脱脂乳、0.2%聚乙烯吡咯烷酮作保护剂。1.不同微生物适用的保护剂由于细菌、病毒、支原体、立克次氏体、酵母菌等生物学特性不同，其适用的冻干保护剂也不相同。病原性细菌：适用的冻干保护剂有10%蔗糖，5%蔗糖脱脂乳，5%蔗糖，1.5%明胶，10%~20%脱脂乳，含1%谷氨酸钠的10%脱脂乳，5%牛血清白蛋白的蔗糖，灭活马血清等。厌氧细菌：含0.1%谷氨酸钠的10%乳糖，10%脱脂乳，7.5%葡萄糖血清等。病毒：常用下列物质的不同浓度或按不同的比例混合组成冻干保护剂。这些物质有明胶、血清、谷氨酸钠、羊水、蛋白胨、蔗糖、乳糖、山梨醇、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮等。支原体：50%马血清、1%牛血浆清蛋白、5%脱脂乳、7.5%葡萄糖加马血清等。立克次氏体：常用10%脱脂乳。酵母菌：可用马血清或含7.5%葡萄糖的马血清，含1%谷氨酸钠的10%脱脂乳。2.几种兽用生物制品常用的保护剂（1）5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂用蔗糖（乳糖）5g，脱脂乳加至100ml，经充分溶解后100C蒸气间歇灭菌3次，每次30min，无菌检验后用于配苗。用于羊痘冻干苗、鸭瘟冻干苗的保护剂。（2）明胶蔗糖保护剂明胶2%~3%（重量/容积）、蔗糖5%（重量/容积）、硫脲1%~2%（重量/容积）。先将12%~18%明胶液、30%蔗糖液和6%~12%硫脲液加热溶解，116C高压灭菌30~40min。然后按组成比例进行配苗。适用于猪肺疫弱毒冻干苗、猪丹毒弱毒冻干苗等细菌性疫苗保护剂。（3）聚乙烯吡咯烷酮乳糖保护剂聚乙烯吡咯烷酮K30～35量1g，乳糖10g，蒸馏水加至100ml。混合溶解后，120℃高压灭菌20min，经无菌检验后用于配苗。4）SPGA保护剂蔗糖76.62g，磷酸二氢钾0.52g，磷酸氢二钾1.64g，谷氨酸钠0.83g，牛血清白蛋白10g，无离子水加至1000ml，混合溶解后滤过除菌，经无菌检验后，用于鸡马立克氏病、火鸡疱疹病毒疫苗等的配苗。......2.冻干保护剂的作用机理（1）“水替代”假说冻干保护机理中的“水替代”假说认为，当冷冻干燥时，保护剂可与生物大分子的失水部位形成氢键，替代保持生物大分子空间结构和生物活性所必需的水分子，从而减轻了生物大分子冻干损伤。1）保护剂对细菌细胞膜的保护水分子可通过氢键与细胞膜中磷脂的极性端相连，而且每个磷脂的极性端与其他磷脂分子的极性端被水分子隔开。当磷脂干燥脱水时，极性端的密度增加，使处于液晶态的脂膜变成凝胶态，导致细胞膜结构发生相变，在室温下复水时，处于凝胶态的干燥质膜又经历了从凝胶态到液晶态的转变，由于膜经历了状态的转变，某些区域产生缺陷，使得膜渗漏，造成细胞死亡。冻干保护剂特别是糖类保护剂分子上的羟基具有与膜磷脂上的磷酸集团连接形成氢键的能力，从而阻止和限制细胞膜因脱水而融合，降低相变温度（Tm），使脂膜不易向凝胶相转变而保持液晶相，增加膜的流动性。Samuel等利用傅立叶变换红外光谱法（FTIR）测量了E.coli和B.thuringiensis的膜相变温度，干燥时不加糖，E.coli和B.thuringiensis的Tm高于室温，干燥时加入海藻糖或蔗糖，可使干燥细胞的Tm降至室温之下。天然保护剂中的血浆脂蛋白和卵黄脂蛋白具有与细胞膜脂蛋白类似的β折叠结构，两者具有良好的亲和性，从而对膜脂蛋白具有良好保护作用。2）保护剂对蛋白质的保护由于蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性。（2）“玻璃态”假说“玻璃态”假说认为，在含有保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂不发生结晶时，保护剂与活性组分混合物就会被玻璃化（vitrification）。玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种状态，其黏度极大，一般为1012~1014Pa·s，由于这种非晶体结构的扩散系数很低，故在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱，不利的化学反应能够被抑制，从而提高被保存物质的稳定性。研究表明，单糖、双糖、多羟基化合物以及结构蛋白质、酶都能显示玻璃行为，只是玻璃化转变温度Tg不同。保护剂在蛋白质周围形成玻璃体，使蛋白质的链段运动受阻，阻止蛋白质的展开和沉淀，从而抑制了蛋白质结构亚能级与结构松弛之间的相互转换，维持蛋白质分子三维结构的稳定性。有效保护剂的使用可以改变体系的Tg曲线，使体系的玻璃化转变温度升高，从而在较高的温度下使体系保持玻璃态而稳定。糖类在保护作用中效力的顺序由强到弱依次为海藻糖、麦芽糖、蔗糖和葡萄糖，这恰好与它们玻璃态转变温度由高到低的顺序一致。海藻糖能够促进玻璃体的形成，减少对蛋白质及细胞有破坏作用的冰晶的生成。若向体系中添加硼酸盐离子，则可通过与海藻糖分子间形成可逆的交联网状物来提高干燥基质的玻璃化转变温度，从而增强海藻糖的稳定效果。Kets等向蔗糖溶液中添加柠檬酸钠也可获得比蔗糖的Tg值要高的玻璃化转变温度。SatoshiOhtake等人研究了糖-磷酸盐混合物对脱水体系DPPC（1，2-dipalmitoylposphatidycholine）稳定性的影响，结果表明当有磷酸盐存在时，海藻糖-DPPC体系、蔗糖-DPPC体系、棉子糖-DPPC体系的Tg值均要比无磷酸盐存在时的Tg值要高。目前，“水替代”假说和“玻璃态”假说并不能完全解释所有的冷冻干燥保护过程。例如，对L-天门冬酰胺酶的研究表明，虽然四甲基葡萄糖和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）都不能作为水替代物与蛋白质分子形成氢键，但它们在干燥过程中仍然能有效防止蛋白失活，“水替代”假说不能解释这一现象。同样，“玻璃态”假说也有一些不能解释的问，如高温下海藻糖对生物制品的稳定性问题。总之，对冻干过程的保护机理仍需深入研究。...（2）产品预冻1）制品的玻璃化对于具有一定初始浓度的细菌制品，其预冻过程一般通过“两步法”来完成。第一步是以一般速率进行降温，让细胞外的溶液中产生冰，细胞内的水分通过细胞膜渗向胞外，胞内溶液的浓度逐渐提高；第二步是以较高速率进行降温，以实现胞内溶液的“玻璃化”。此法又称“部分玻璃化法”。该过程可用图3-1来表示。当初始浓度为A的溶液（A点）从室温开始冷却时，随着温度的下降，溶液过冷到B点后将开始析出冰，结晶潜热的释放又使溶液局部温度升高。溶液将沿着平衡的熔融线不断析出冰晶，冰晶周围剩余的未冻溶液随温度下降，浓度不断升高，一直下降到熔融线（Tm）与玻璃化转变曲线（Tg）的交点（D点）时，溶液中剩余的水分将不再结晶（称为不可冻水），此时的溶液达到最大冻结浓缩状，浓度较高，以非晶态基质的形式包围在冰晶周围，形成镶嵌着冰晶的玻璃体。2）降温速率与预冻温度预冻速度决定了制品体积大小、形状和成品最初晶格及其微孔的特性，由此造成不同的升华速率和干燥后制品的不同结构。预冻速度一般可控制在每分钟降温1℃左右。冻干制品溶液的最佳冷冻速度是因制剂本身的特性不同而变化的。如蛋白多肽类药物的冻干，慢速冻结通常是有利的，而对于病毒、疫苗来说，快速降温通常是有利的。对结品性制剂面言，冻结速度一般不要太快，冻结速度快虽然便于形成大块冰结品体，维特通畅的升华通道，使升华速度加快，但如果结晶过大、晶核数量过少、制剂的结品均匀性差，也不利于升华干燥。对于一些分子呈无规则网状结构的高分子药物，速冻能使其在药液中迅速定型，使包裹在其中的有机溶媒蒸气在真空条件下迅速逸出，反而能使升华速度加快。预冻温度须低于制品的玻璃态和橡胶态转变温度，以保证箱内所有的制品温度都低于共熔点，使其全部凝结成固体；对于许多溶液，它们的玻璃化转变温度一般要比共晶温度低10~30℃。至于预冻的最终温度是控制在低于共晶温度还是低于玻璃化转变温度，这主要取决于我们希望制品在冻结过程中所达到的固化状态。对于具有类似膜结构或活性成分制品的冷冻干燥，应尽量使其最终冻结温度低于玻璃化转变温度。另外，与晶态药品相比，玻璃化药品具有较高的溶解速度，而对于许多药品来讲，提高其在体内的溶解速度，就可提高该药的生物活性和药效。一般制品预冻温度在共熔点以下10~15℃保持2~3h，保证冷冻完全；多数疫苗的共熔点在一15~-20℃之间，因此预冻温度要在一35~-40℃。目前最常用的一种冷冻方法是冻干机板层冷冻。（3）一次干燥一次干燥（升华干燥）是指低温下对制品加热，同时用真空泵抽真空，使其中被冻结成冰的自由水直接升华成水蒸气。待成品中看不到冰时，则可认为一次干燥已完毕，此时制品温度迅速上升，接近板温，制品中最初水分的90%以上已被除去。1）一次干燥中制品温度的控制在升华干燥过程中，制品吸收热量后所含水分在真空下升华成水蒸气，消耗大量热能，使得制品温度较板层温度低十几甚至几十度。多数动物用疫苗一次干燥应在-30℃或以上温度（低于产品塌陷温度尤其是共熔点温度）下进行，因此板层温度一般在-10~-3℃之间。如果温度过高，会出现软化、塌陷等现象，造成冻干失败；如果温度过低，不仅给制冷系统提出了过高的要求，而且大大降低了升华过程的速率，费时又耗能。尽管在有些场合下，一次干燥的最大许可温度由制品的相变温度或共晶温度决定，但一般的情况下，预冻的制品中都有一定份额的无定形态，故应当将冻干的一次干燥过程控制在玻璃化转变温度Tg以下进行。在干燥过程中，如制品干燥层温度上升到一定数值时，其部分干燥物质所形成的多孔性骨架刚度降低，干燥层内颗粒出现脱落，直至骨架塌陷，造成已被干燥部分的微孔通道被封闭，阻止升华的进行，使升华速率减慢，最终可导致冻干产品的残余水分含量过高，产品的复水性与稳定性差。此时的温度称为塌陷温度Tc。塌陷温度T。是在冻干过程中样品所特有..（4）二次干燥.的一特征温度，是由制品材料及干燥层的多孔性结构所决定，还与制品的水分含量有关，随着水分含量的升高，塌陷温度将降低。Kasraian等认为，在多数情况下，塌陷温度Tc要比玻璃化转变温度Tg高20℃左右。在一次干燥过程中，冻结层温度要低于共晶点温度Te或玻璃化转变温度Tg，干燥层的温度要低于塌陷温度Tc。对于一个特定的冻干制品，其共晶温度、玻璃化转变温度可通过DSC测得，而塌陷温度可通过冻干显微镜测得。目前大多数的操作，都是在整个升华干燥过程中保持加热温度不变。关于是否应当这样，存在两种不同的观点。一种观点认为，在升华干燥阶段，随着水分的升华，使制品浓度升高，其玻璃化转变温度也会提高，这样升华干燥过程中就可以适当逐渐提高温度，加快升华进行；另一种观点认为，在升华干燥阶段，升华的只是游离在网状结构空隙中的自由水，不会对物料实体的玻璃化转变温度产生影响，因此升华干燥过程中的加热温度仍应保持不变。实际上这两种情况都可能出现，是和冷却固化的情况有关的。2）一次干燥中冷阱温度的控制冷阱位于真空泵进口前，升华产生的水蒸气利用压差的作用到达冷阱，重新结成霜，如果没有冷阱或其温度不够低，就会导致冻干室内水蒸气压升高，制品升华界面压力和温度都会上升，使得制品融化。冷阱的温度要比制品升华界面的温度低得多，如20K或更多。对于多数制品的冷冻干燥，冷阱表面温度在-40~-50℃之间已能满足要求。3）一次干燥中的真空度一次干燥中真空度应维持在100~120Torr（13332~16000Pa）。一般说来，在升华干燥过程中真空度是维持不变的，但也可以采用循环压力法，即控制真空系统的压力在一定范围内上下波动，以期提高干燥速度。大量研究表明，在干燥过程中短期地略微提高干燥室压力（266~666Pa），同时干燥层表面温度维持在接近其允许值，可以缩短干燥时间。但干燥室压力必须低于升华界面压力，而升华界面的压力所对应的升华界面温度必须低于制品在相应浓度下的玻璃化转变温度。在升华过程中，有时可采用向冻干箱内充注气体，以形成对流传热，但这一部分空气量会降低真空度，因此，要对真空度进行控制，使其既能形成恰当的对流传热，又能使制剂表面始终处于匀速干燥的压力状态。4）影响干燥效率的因素在一次干燥过程中，除了制品温度、冷阱温度、干燥室压力影响干燥快慢以外，预冻速度也影响着升华效率。慢冻形成大冰晶，升华后形成大的孔隙，有利于升华进行，干燥速度快；速冻形成细小的冰晶，升华后留下细小的通道，干燥速度慢。但慢冻时，尤其是瓶装物料采用隔板预冻的情况下，冰晶首先在瓶子底部形成，溶质向顶部迁移，使上部溶液的浓度不断增大，以至于在表面形成一层硬壳，阻止升华进行，因此，要避免该现象的发生，一般采用快速冻结。另外，如果制品浓度大，冻结后形成的密度大，阻碍升华进行，使干燥效率降低。近年来发现，在冻干配方中加入叔丁醇后，冻结时会形成针状结晶，冰晶升华后留下了管状通道，使水蒸气阻力大大减小，升华速率显著提高，节省了时间和能耗。二次干燥（解吸干燥）是在较高的温度下对制品加热，使制品中被吸附的部分“束缚水”解吸变成“自由”的液态水再吸热蒸发成水蒸气的过程，加热量主要用于被束缚水的解吸作用和蒸发。由于升华干燥之后，在干燥制品的多孔结构表面和极性集团上结合水的吸附能量很大，因此必须提供较高的温度和足够的热量才能实现结合水的解吸过程。该过程中，制品的含水量不断减少，其玻璃化转变温度是不断提高的，制品温度也可以逐渐提高，但其数值要低于玻璃化转变温度Tg或塌陷温度Tc。在二次干燥过程中，板层温度至少每小时增加5~10℃。成品温度应该迅速升至板层温度或以上，否则制品水分增多且易倒塌。二次干燥目的虽然是使残存在多孔疏松状固体中的水被去除，但适当的水分（通常1%~1.5%）对于保持疫苗结构完整性和活性也是必要的。制品水分过低，菌体表面亲水基团失去保护，会直接与氧接触，影响菌体的存活率。最终板层温度是成品水分含量的一个主要...决定因素，其数值不能超过制品的最高允许温度，对于蛋白质药物其最高允许温度一般应低于40℃，对于绝大多数动物用疫苗，最终板层温度应该在25~35℃之间。一般细菌性产品最终板层温度为30~35℃，病毒性产品为25℃。影响制品水分的因素还有真空度的控制，当从一次干燥进入二次干燥时，必须尽可能提高真空度，这样有利于残余水分的逸出。在二次干燥阶段的初期，进行真空控制的目的不是为了提高水蒸气的全压，而是为了强化从隔板到制剂的热传导，降低制剂的残余水分。对于二次干燥终点的判定，目前多采用剩余气体判断法。试验操作方法是：切断冻干箱与真空泵间的通道，观察在冻干箱内真空度的破坏速度。对于水蒸气，若压力变化速度为<5Pa/3min，则可大致认为其已达到干燥终点。这个方法还应通过取样分析制剂的水分残留量来验证确定。以下对整个冷冻干燥过程用状态图3-2进行。制品由常温A开始冷却；越过凝固点B，过冷至点C，形成晶核；制品温度返回凝固点D；在整个结冰过程中，随着温度的下降，冻结水增加，未冻相的溶质浓度不断提高。当到达共晶点T。时，理论上应形成共晶体，但对大多数生物制品，溶质很少在温度T。下结晶。因此，如果温度继续降低，冰还会进一步形成，未冻相的溶质浓度还会进一步提高，致使溶液处于过饱和状态，即沿着T.ET。’线，直至T。’点，发生玻璃化转变。此时过饱和的未冻相就形成玻璃态，整个物料就成为既有冰晶，又有玻璃体的复杂固态结构。再进一步冷却，由点T。’到点F，温度降至T。’以下，但浓度不变。理想的干燥过程应沿路径FGH进行，即干燥过程中物料的温度始终保持低于相应浓度的玻璃化转变温度T。'，这样分子的流动性极小，能够保持物料的稳定，避免出现塌陷等现象。如果冷却温度不够低，如冷却到点E（E点温度高于相应浓度的玻璃化转变温度）就开始加热，干燥过程就会沿路径EGH进行。在干燥的最初阶段，由于冰晶的存在，物料暂时不会出现塌陷；但只要有部分物料已被干燥，其中的冰晶已消失，而温度又在玻璃化转变温度T。以上，再继续加热就可能出现塌陷等情况。（5）密封保存冻干结束后，通过板层液压升降系统，将半加塞的疫苗瓶在真空状态下密封，或者充惰性气体（氮气或氩气）的条件下进行。1）包装材料的选择玻璃的理化性质稳定，不易与药物反应，应用较多，棕色玻璃能阻挡波长小于470nm的光线透过，故光敏冻干品可用棕色玻璃包装。使用的胶塞应和管状玻璃瓶配套，检测的方法是将其密封后置45℃水浴24h，观察疫苗瓶中是否有水被吸入。胶塞应该在135℃干燥4h，如果胶塞通过高压灭菌（121℃40min）将使胶塞中的水分逐渐扩散到疫苗中，导致疫苗水分含量增加1%~5%以上，对冻干物质的框架结构起到破坏作用，因此，采用干烤（135℃4h）的胶塞来盖封冻干疫苗，对疫苗的长期保存和运输过程是非常必要的。2）冻干品的储存Frank认为，储存温度至少应该比玻璃化转变温度低20℃，也就是说，如果希望在常温下（25℃）保持冻干品的稳定性，那么制品的玻璃化转变温度Tg值应当高于45℃。冻干制品的储藏温度一般是室温。对于某些药品，要求储藏温度为4℃，特殊的要求-18℃。兽用冻干活疫苗通常在2~8℃保存，冻干产品密封后不能在低于-20℃温度下保存，因为在-20℃以下，胶塞失去弹性，真空很易失去。..