两种快速检测碱性蛋白酶活性的电泳染色方法的建立

摘 要：为确定粗酶液中碱性蛋白酶的种类及其活力的相对大小,根据碱性蛋白酶在碱性条件下水解蛋白质的原 理,将粗酶液经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)分离后,采用下面 2种进行活性染色:(1) 把分离胶浸泡在酪蛋白溶液中,然后用考马斯亮蓝染色;(2)将分离胶与另外制备的含有底物的胶贴在一 起夹紧,浸泡在特定pH值的缓冲液中,将含有底物的分离胶用考马斯亮蓝染色。结果明:与福林法测定 蛋白酶活力相比,2种检测方法都更加灵敏,而且比较直观。 关键词：碱性蛋白酶;活性染色;电泳 中图分类号：O652 文献码：A 文章编号：1007-550X（2006）11-0010-03 碱性蛋白酶是一类最适pH值为碱性的蛋白酶。因其在碱性 pH下有很高的活性与稳定性,所以具有相当可观 的经济价值[1],广泛应用于洗涤、制革、丝绸等工业。到 20世纪末,碱性蛋白酶的市场份额占酶制剂总销售额的 24%以上,被认为是最重要的应用型酶类[2] 为了从粗酶液中分离新型的碱性蛋白酶,建立方便快捷的检测方法十分必要。基于碱性蛋白酶在碱性条件下水 解蛋白质的原理,设计了2种快速检测碱性蛋白酶电泳活性的染色方法。 1材料与方法 1.1材料 碱性蛋白酶发酵液 由福大百特科技发展有限公司提供。发酵液经室温下离心(4800rpm)40min后,弃沉淀,上 清即为粗酶液,置于-20℃下储存。 1.2碱性蛋白酶活性的测定 采用Folin-酚试剂法。取1mL样品,加入1mL2%酪蛋白溶液,反应20min后用2mL5%TCA中止反应。对照组 先加入TCA。离心后取出0.5mL上清液,加入2.5mL0.8mol/L的NaCO3溶液中,然后再加入0.5mLFolin-酚试剂,振 荡。30min后在660nm处测量吸光值。酶活力单位(U)以每毫升酶液在50℃,pH8.4的条件下,每分钟水解酪蛋白产生 1μg酪氨酸所需的酶量为一个酶活力单位(U)。 1.3 PAGE 非变性PAGE参照文献3中的方法,采用Tris-HCl不连续系统,5%浓缩胶,7.5%分离胶。样品缓冲液配制亦参 照文献3。先120V电泳0.5h,再加高电压到400V电泳3h。 1.4 活性染色 蛋白酶的上样量、底物用量与反应时间都会影响蛋白酶对酪蛋白的酶解,从而影响活性染色效果。实验中对上 两种快速检测碱性蛋白酶活性的 电泳染色方法的建立 刘心义,汪少芸,叶秀云 (福州大学生物工程研究所,福建 福州 350002) 收稿日期:2006-08-27 作者简介:刘心义(1983-),男,河南商丘人,研究生,主要从事蛋白质化学方面的研究。 第11期(总第210期) №11(Serial№11) 福 建 轻 纺 TheLight&TextileIndustriesofFujian 2006年11月 NOV.2006 f 高亮 上 样 量 底 0.1μL 1μL 10μL 1# 胶左 1# 胶中 1# 胶右 2# 胶左 2# 胶中 2# 胶右 3# 胶左 3# 胶中 3# 胶右 4# 胶左 4# 胶中 4# 胶右 5# 胶左 5# 胶中 5# 胶右 6# 胶左 6# 胶中 6# 胶右 0.2%酪蛋白溶液浸泡 (转印胶含0.2%酪蛋白) 0.4%酪蛋白溶液浸泡 (转印胶含0.4%酪蛋白) 0.8%酪蛋白溶液浸泡 (转印胶含0.8%酪蛋白) 15min 30min 15min 30min 15min 30min 物 浓 度 反 应 时 间 述3个量进行了正交实验设计(如表1),以确定最佳实验条件。采用2种方法活性染色。一种方法是:电泳后直接将 6块分离胶浸泡在酪蛋白溶液中,取出洗净后考染;另一种方法是:配制 6块含有酪蛋白的分离胶,其大小与进行电 泳的那些分离胶相同。电泳结束后,将 2种分离胶两两对应合在一起夹紧,置于 pH8.4的硼砂硼酸缓冲液 (0.05mol/L)中,取出后考染。染色使用考马斯亮蓝R-250,10%乙酸20%乙醇脱色过夜。 表1正交实验设计 6块胶每块各走3个样品,样品中粗酶液含量分别为0.1μL,1μL与10μL。1#-6# 胶分别对应不同的底物用 量和反应时间。 2 结果与讨论 2.1 粗酶液碱性蛋白酶活力的测定 图1酶活测定标准曲线（横坐标为酪氨酸浓度，纵坐标为660nm处吸光值） 由图 1可得出,酶活的计算公式为:酶活力(U)=(样品吸光值-对照吸光值)×35.0875,粗酶液稀释 10倍后所 得样品与对照吸光值之差为0.684。故碱性蛋白酶活力为240U/mL粗酶液,这表明粗酶液中含有碱性蛋白酶。 2.2 蛋白酶上样量、底物用量与反应时间条件的优化 利用表1,对影响活性染色的3个量(蛋白酶的上样量、底物用量与反应时间)进行全面正交设计试验。为使染色 时背景(图3)足够深,底物浓度不能太低。浸泡时选取 0.2%、0.4%和 0.8%的酪蛋白溶液,转印时含底物的分离胶中 酪蛋白含量亦分别选取 0.2%、0.4%和 0.8%。上样酶活力 2种染色方法相同,均选取 2.4×10-3U,2.4×10-4U,2.4× 10-5U3种。反应时间均选取15min,30min2种。 结果表明:上样酶活力 2.4×10-4U(即含粗酶液 1μL),反应时间 15min,浸泡时酪蛋白溶液 0.4%(如图 1M,即 第11期 刘心义，汪少芸，叶秀云：两种快速检测碱性蛋白酶活性的电泳染色方法的建立 ·11· 3# 胶中),转印时酪蛋白含量0.2%时(如图2M,即1# 胶中),活性染色效果最佳。 图2浸泡法活性染色 图3 转印法活性染色 图4对照组活性染色 （L，M，R上样量分别 （L，M，R上样量分别 （L，M，R上样量分别 为0.1μL，1μL与10μL） 为0.1μL，1μL与10μL） 为0.1μL，1μL与10μL） 如图4,上样样品经煮沸失活,没有蛋白酶活力。样品活性染色电泳图(图2,3)与对照组活性染色电泳图(图4) 相比,有清晰的空白带。说明这些空白带是由碱性蛋白酶分解底物形成的。 2.3 粗酶液PAGE及活性染色结果 从图2与图3中可以看出,粗酶液中主要含有 3种以上的碱性蛋白酶,其活力相对大小不一。采用上述方法对 粗酶液处理过程进行了追踪。PAGE分析表明,经热变性后,蛋白酶只剩下1种(图略)。 据此,将进一步分离纯化这 种稳定性较好的碱性蛋白酶,并进行性质研究,以克隆其编码基因。 2.4 2种活性染色方法检测蛋白酶活性的特点 2种活性染色方法中,活性染色过程中浸泡法比较省时,仅用15min,但配制足量用来浸泡的酪蛋白溶液会消耗较 多的酪蛋白,而且酪蛋白溶液配制和保存都比较麻烦。转移法节约酪蛋白的用量,但需要额外配制含底物的分离胶。 Folin-酚试剂法检测蛋白酶所需粗酶液约 100μL,而电泳分析时仅需 0.1μL左右。这表明活性电泳法检测蛋 白酶比Folin-酚试剂法更灵敏,对研究含量较少的蛋白酶有重要意义。更重要的是,PAGE活性染色能直观地反映蛋 白酶的种类及其活力的相对大小,因此能用来分析发酵过程中以及生物发育过程中的蛋白酶数量和活性变化,并可 以追踪蛋白酶分离纯化过程中的酶活变化。 综上所述,本文基于碱性蛋白酶在碱性条件下水解蛋白质的原理,建立了两种快速检测碱性蛋白酶电泳活性的 染色方法,为方便快捷检测蛋白酶活力提供了必要的实验基础。 参考文献： [1]GaneshKumar.C,Hiroshi.T.Microbialalkalineproteases:Fromabioindustrialviewpoint[J].BiotechnologyAdvances, 1999,17:561-594. [2]AnwarA,SaleemuddinM.AlkalineProtease:AReview[J].BioresourceTech,1998,64:175-183. [3]汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版社,2000.111-123. ·12· 福 建 轻 纺 ·2006·