可降解血管支架材料的表面性能及生物相容性

可降解血管支架材料的表面性能及生物相容性张红梅，张利鹏(内蒙古医科大学附属医院急诊科，内蒙古自治区呼和浩特市010050)引用本文：张红梅，张利鹏.可降解血管支架材料的表面性能及生物相容性[J].中国组织工程研究，2016，20(43):6445-6450.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.43.009  ORCID:0000-0003-3389-3469(张红梅)文章快速阅读：可降解镁合金血管支架材料具有良好的生物胞形容性，满足临床应用的需求张红梅，女，1981年，内蒙古自治区包头市人，汉族，2011年内蒙古医科大学毕业，硕士，主治医师，研究方向为心血管内科。中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)43-06445-06稿件接受：2016-08-02文题释义：可降解血管支架：支架主要由可自然分解的材料制成，在植入人体血管之后，在被治疗的血管愈合后、不再需要支架支撑时，支架可以随着时间的推移不断降解，最终完全消失。镁及镁合金具有优良力学性能和生物相容性，是生物材料领域的研究热点之一。该支架既具有金属支架的强度，又具有可降解聚合物支架的生物可吸收性，具有独特的优势。生物相容性：临床所使用的支架材料应该具备良好的生物相容性，具体来看，主要涉及到血液相容性和细胞相容性两个方面。细胞相容性方面，要注意观察材料对细胞生长的影响情况。血液相容性方面，各种生物材料的应用过程中，应该满足良好的抗凝血性能，从而会有利于降低血栓形成倾向，避免临床治疗中各种风险事件的出现。摘要背景：临床治疗多种心血管疾病的过程中，可降解支架植入治疗是一种常用的手段，相应的支架应该具备良好的表面性能和生物相容性。目的：观察可降解血管支架材料的表面性能，并对其生物相容性进行分析。方法：制备人工血浆，对可降解镁合金支架进行浸泡，利用电镜扫描观察材料表面的腐蚀情况。制备材料浸提液，进行细胞毒性实验，观察浸提液培养人脐静脉内皮细胞的毒性反应级别。进行血小板黏附实验和溶血率测试，检测材料的细胞相容性和血液相容性。结果与结论：人工血浆中浸泡10d后对材料进行电镜扫描和观察，可以观察到在材料表面形成了一层均匀分布的腐蚀层。在对材料进行吹干的过程中，腐蚀层出现裂纹。对腐蚀产物进行清洗之后观察，材料腐蚀表面主要为呈均匀分布的腐蚀坑点。细胞毒性实验中，阳性对照组中细胞无吸光度值，几乎全部死亡。材料浸提液组中不同人脐静脉内皮细胞培养时间，反应级别均为0或1级。经黏附实验，电镜扫描可以发现在材料表面血小板大多呈圆盘状，一些血小板发生形变，伸出伪足，未出现血小板聚集现象。经溶血率测试，材料的溶血率为3.15%。对国家医疗器械生物学评价标准进行比较，符合溶血率小于5%的要求。结果表明，可降解镁合金血管支架材料具有良好的耐腐蚀性能，且具有良好的细胞形容性和血液相容性，可以满足临床应用的需求。关键词：生物材料；材料相容性；镁合金；血管；支架；可降解材料；腐蚀性能；细胞毒性；细胞粘附；溶血率；生物相容性主题词：合金；支架；组织工程基金资助：内蒙古自治区基金项目(2015MS1024)Biodegradablevascularstentmaterials:surfacepropertiesandbiocompatibilityZhangHong-mei,ZhangLi-peng(EmergencyDepartmentofAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010050,InnerMongoliaAutonomousRegion,China)AbstractBACKGROUND:Biodegradablestentimplantationisacommonlyusedmethodintheclinicaltreatmentofavarietyofcardiovasculardiseases.Importantly,thecorrespondingstentshouldhavegoodsurfacepropertiesandbiocompatibility.OBJECTIVE:Toobservethesurfacepropertiesofthebiodegradablevascularstentmaterial,andtoanalyzeitsbiocompatibility.METHODS:Artificialplasmawaspreparedforsoakingthebiodegradablemagnesiumalloystent,andthecorrosionofthematerialwasobservedbyscanningelectronmicroscope.Stentextractionsolutionwaspreparedandcytotoxicitytestwascarriedouttoobservethetoxicitylevelofhumanumbilicalveinendothelialcellsculturedintheculturemedium.Plateletadhesiontestandhemolysistestwereperformedtodetectcellandbloodcompatibilityofthematerial.RESULTSANDCONCLUSION:Afterthe10-dayimmersioninartificialplasma,thematerialwasscannedandauniformcorrosionlayerwasfoundonthesurfaceofthematerial.Duringthedryingofthematerial,somecracksappearedonthecorrosionlayer.Afterthecorrosionproductswereremoved,therewerecorrosionpitsuniformlydistributedonthecorrosionsurfaceofthematerial.Inthecytotoxicitytest,therewerenoabsorbancevaluesinthepositivecontrolgroup,andalmostallofthecellsdied.Afterculturedinthematerialextraction,thetoxicitylevelofhumanumbilicalveinendothelialcellswasgraded0or1.Intheadhesiontest,plateletsonthestentsurfaceweremostlydisk-shapedunderscanningelectronmicroscope,someofwhichweredeformedandextendedpseudopodia,butnoplateletaggregationoccurred.Thehemolysisrateofthematerialwas3.15%,inaccordancewiththerequirementofthehemolyticrate<5%.Theseexperimentalresultsshowthatthebiodegradablemagnesiumalloystentmaterialhasgoodcorrosionresistanceandgoodcellandbloodcompatibility,whichcanmeetthedemandofclinicalapplication.Subjectheadings:Alloys;Stents;TissueEngineeringFunding:theFoundationofInnerMongoliaAutonomousRegion,China,No.2015MS1024Citethisarticle:ZhangHM,ZhangLP.Biodegradablevascularstentmaterials:surfacepropertiesandbiocompatibility.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(43):6445-6450.ZhangHong-mei,Master,Attendingphysician,EmergencyDepartmentofAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010050,InnerMongoliaAutonomousRegion,China0 引言 Introduction既往血管支架植入治疗多使用常规金属支架，而这种支架在植入后则长期作为异物存留在患者体内，对血管周边组织等均有一定的刺激作用，导致不同程度组织反应的出现，甚至引发血管的慢性损伤[1]。理想的血管支架具有良好的可降解性，进入机体后，为局部提供所需支撑作用后，可逐渐发生降解[2]。1988年，Stack等[3]以高分子材料左旋聚乳酸制成第一个生物可降解支架，该支架可以在9个月内完全降解。近年来，越来越多的生物材料开始应用于血管支架中。镁是一种人体必需的元素，可以参与多种新陈代谢过程，且极易在人体环境中被腐蚀并逐渐降解，是一种理想的血管支架材料[4]。利用镁合金制备的血管支架既具有一定的金属材料特性及良好的机械强度，也具有良好的可降解性，在进入机体之后可逐渐消失，避免各种不良反应的出现，已达到理想的医疗效果[5]。文章对可降解镁合金血管支架材料的表面性能和生物相容性进行分析，为其临床治疗提供的实验依据。1 材料和方法 Materialsandmethods1.1 设计 体外观察性实验。1.2时间及地点 实验于2016年3至5月在内蒙古医科大学附属医院实验室完成。1.3 材料 可降解镁合金支架由清华大学、哈尔滨工业大学、北京大学第九临床医学院、共同研发，材料为新型可降解镁合金WE43。支架采用弧梁混合式结构设计，轴向单元间采用n型连接杆连接，经参数优化的弧梁混合式结构保证了支架的径向力学稳定性，n型连接杆保证了支架轴向的柔顺性。支架截面的梯形比例系数采用1∶4设计，减少对血管壁的接触应力，并改善支架表面的血流动力学状况。新鲜人血由内蒙古医科大学附属医院实验室提供。本次研究相关方案均提交本院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。表1材料浸提液组人脐静脉内皮细胞的相对增殖度(±s，%)Table1Therelativegrowthrateofhumanumbilicalveinendothelialcellsculturedinthematerialextraction图1可降解血管支架表面粗糙度Figure1Thesurfaceroughnessofthebiodegradablevascularstent图注：支架内外表面及切割面均处于良好的光滑状态。BA图2可降解血管支架腐蚀表面超微形态Figure2Corrosionsurfacemorphologyofthebiodegradablevascularstent图注：图中A为材料表面形成了一层均匀分布的腐蚀层，吹干过程中腐蚀层出现裂纹；B为材料腐蚀表面主要为呈均匀分布的腐蚀坑点。标尺：20μm。图3可降解血管支架的细胞黏附实验结果Figure3Celladhesionassayofthebiodegradablevascularstent图注：图中电镜扫描可以发现在材料表面血小板大多呈圆盘状，一些血小板发生形变，伸出伪足。标尺：20nm。1.4方法1.4.1 可降解血管支架材料表面性能观察[6] 为了更好地模拟人体血液成分，制备人工血浆，即含血清蛋白浓度为40g/L的DMEM溶液。按照体积比30mL∶1cm2的比例将人工血浆与可降解镁合金支架材料试样进行混合，每24h更换一次人工血浆，连续浸泡10d。浸泡结束后，利用扫描电子显微镜对材料的表面腐蚀情况进行观察。对表面腐蚀物进行清除，观察支架腐蚀后的表面形貌。1.4.2 细胞相容性检测[7-10] 制备可降解镁合金支架材料浸提液，利用RPMI1640培养基(含胎牛血清)对接种培养板上的人脐静脉内皮细胞进行培养，设为观察组。阴性对照组为0.64%苯酚的RPMI1640培养基培养的细胞。2组细胞均设置3孔复份，连续培养5d，每天取出各孔细胞添加20μLMTT，培养4h后添加DMSO，利用酶标仪测量490nm处吸光度值，计算细胞的相对增殖度。相对增殖度(%)=观察组平均吸光度值÷对照组平均吸光度值×100%。其中，如果相对增殖度≥100%，则视为0级反应，相对增殖度为75%-99%视为1级反应，小于75%视为2级反应，0级和1级时视为细胞毒性符合临床生物材料的安全性需求。 1.4.3 血液相容性实验血小板黏附实验[11-13]：新鲜人血添加枸橼酸钠后离心，获得富血小板血浆。材料样品置于血浆中，在培养箱中放置1h后取出，PBS洗涤后添加戊二醛溶液中，置于4℃环境下，1h后取出，梯度乙醇脱水，干燥后利用扫描电镜观察血小板黏附后的材料表面。另取部分材料，置于血浆中，置于恒温水浴中进行孵育，30min后取出，去掉表面血浆，PBS清洗3次，置于24孔板中，添加戊二醛固定液。1h后添加罗丹明进行染色，并置于倒置显微镜下进行观察。溶血率测试[13-14]：新鲜人血抗凝后利用生理盐水进行稀释备用。釆用生理盐水溶液作为浸提介质，浸提温度为(37±2)℃。取0.1mL人血稀释液与5mL材料浸提液加入到试管中，置于37℃水浴60min。阳性对照为5mL去离子水+0.1mL稀释血液，阴性对照为5mL生理盐水+0.1mL稀释血液。离心后置于545nm波长处对上清液吸光度值进行检测，并计算溶血率。溶血率(%)=(样品吸光度值-阴性对照吸光度值)÷(阳性对照吸光度值-阴性对照吸光度值)×100%。1.5观察指标①观察材料表面腐蚀情况与浸提液培养人脐静脉内皮细胞的毒性反应级别；②进行血小板黏附实验和溶血率测试，观察材料的细胞相容性和血液相容性。1.6统计学分析数据以±s表示。使用SPSS18.0软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results2.1 可降解血管支架表面粗糙度 高清显微镜观察可见，可降解血管支架内外表面及切割面均处于良好的光滑状态(图1)。2.2 可降解血管支架腐蚀表面超微形态人工血浆中浸泡10d后，电镜扫描可见，材料表面形成一层均匀分布的腐蚀层。吹干后，腐蚀层出现裂纹(图2A)。清除腐蚀物后，材料表面存在大量均匀分布的腐蚀坑点，表明材料受到了均匀腐蚀(图2B)。2.3细胞毒性实验结果 阳性对照组中细胞几乎全部死亡。材料浸提液组中不同培养时间人脐静脉内皮细胞的相对增殖度均在95.00%以上，反应级别为0或1级(表1)，提示材料具有良好的细胞安全性。2.4细胞黏附实验结果 电镜扫描可见，可降解血管支架表面血小板大多呈圆盘状，一些血小板发生形变，伸出伪足，未出现血小板聚集现象(图3)。提示材料具有良好的血液相容性。2.5 溶血率可降解血管支架的溶血率为3.15%，符合国家医疗器械生物学评价标准，即符合临床溶血率要求[15]。3 讨论 Discussion心血管疾病的严重威胁人体健康的疾病类型，在对心血管疾病患者进行治疗的时候，支架植入治疗是一种常用的方式[16]。以往大多使用常规金属支架，在有效治疗的同时，存留在血管内的金属支架也存在一些隐患。血管会有规律地收缩、舒张，如果血管一直被支架支撑，血管就会变得僵硬，失去弹性，导致各种不良反应的出现[17]。例如支架部位血管失去弹性、血管再狭窄、血栓形成等，并影响患者后来进行外科搭桥、核磁共振检查等。近年来，新型的血管支架被不断的研制出来。新型支架的优势在于可全降解，支架主要由可自然分解的材料制成[18-19]。在植入人体血管之后，在被治疗的血管愈合后、不再需要支架支撑时，支架可以随着时间的推移不断降解，最终完全消失[20]。镁及镁合金具有优良力学性能和生物相容性，是生物材料领域的研究热点之一[21-23]。该支架既具有金属支架的强度，又具有可降解聚合物支架的生物可吸收性，具有独特的优势。受到血管内部特殊微环境的影响，血管支架应该具有良好的耐腐蚀性能[24-25]。用于人体组织修复的金属材料植入人体后，在空气中自发形成的表面氧化膜将与人体生理环境发生反应,材料与组织之间界面的性质会对金属的耐蚀性以及金属离子释放的程度产生一定影响，进而决定了材料的生物相容性。作者利用人工血浆对血管内部环境进行模拟，以更好的了解不同材料的生物相容性。实验中，在利用人工血浆对材料进行浸泡之后经电镜扫描观察发现，在材料表面形成了一层均匀分布的腐蚀层。在对材料进行吹干的过程中，腐蚀层出现裂纹。对腐蚀产物进行清洗之后观察，材料腐蚀表面主要为呈均匀分布的腐蚀坑点。上述结果表明，材料具备良好的耐腐蚀性，且处于均匀腐蚀状态。对各种医学生物材料而言，均匀腐蚀十分重要。血管支架属于支撑器械，如果在植入人体血管之后出现不均匀腐蚀现象，局部严重腐蚀，便极易导致支架出现局部断裂，影响到支架的整体力学性能和支撑效果[26-27]。而具备良好的均匀腐蚀性能，则可以保证支架可以发挥出理想的支撑作用[28]。 为了保证治疗效果，提高治疗的安全性，临床所使用的支架材料应该具备良好的生物相容性。具体来看，主要涉及到血液相容性和细胞相容性两个方面[29-31]。细胞毒性实验中，阳性对照组中细胞无吸光度值，几乎全部死亡。而材料浸提液组中人脐静脉内皮细胞在不同的培养时间，反应级别均为0或1级，符合临床生物学材料的反应级别要求。各种生物材料的应用过程中，应该满足良好的抗凝血性能，从而会有利于降低血栓形成倾向，避免临床治疗中各种风险事件的出现。在对血接触材料的抗凝血性质进行评估和判断的时候，血小板黏附实验是一种最为直接和常用的方法[32-33]。通过观察血小板在材料表面的黏附情况，可以十分直观的了解到材料的血液相容性[34]。血小板经黏附实验中，经电镜扫描和荧光染色观察，均可观察到少量血小板黏附在材料表面，且未发生聚。另外，通过溶血实验，可以对各种血液接触材料对红细胞的破坏程度进行评估[35]。当前，国内医疗器械生物学评价标准要求溶血率小于5%。实验结果显示，材料的溶血率为3.15%，满足规定的要求。章晓波等[36]也通过研究发现，Mg-3.13Nd-0.16Zn-0.41Zr合金对内皮细胞无毒性，具有理想的耐蚀性能和腐蚀方式，可满足心血管支架在生物性能方面的要求，与此次实验结果基本一致。综上所述，可降解镁合金血管支架材料具有良好的耐腐蚀性能，且具有良好的细胞形容性和血液相容性，可以满足临床应用的需求。但是，实验采用的是体外实验方式，而人体环境与体外环境之间存在较大的差异。为此，关于可降解镁合金血管支架的实际临床应用效果等，还有待在今后予以进一步分析。作者贡献：张红梅进行实验设计，实验实施为张利鹏。利益冲突：文章所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验方案经内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准，实验方案已经患者/家属知情同意。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References[1]袁广银,章晓波,牛佳林,等.新型可降解生物医用镁合金JDBM的研究进展[J].中国有色金属学报,2011,21(10):2476-2488.[2]陈宝爱,罗七一.可降解支架材料热学?机械性能及与受体的生物相容性[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(29):5475-5478.[3]StackRS,CaliffRM,PhillipsHR,etal.InterventionalcardiaccatheterizationatDukeMedicalCenter.AmJCardiol.1988;62(10Pt2):3F-24F.[4]郭清奎.用于制备完全生物可降解心血管支架的高分子聚合物材料的生物相容性降解性能和生物力学性能研究[D].上海:上海交通大学,2012.[5]冯海全,孙丽丽,韩青松,等.狭窄血管内支架变形行为及力学性能模拟研究?[J].功能材料,2015(22):22085-22089,22094.[6]章晓波,毛琳,张佳,等.Mg-Nd-Zn-Zr可降解镁合金心血管支架的制备及性能研究[C]//第二届生物材料与组织工程产品质量控制国际研讨会论文集.2011:142-148.[7]葛淑萍.WE可降解镁基血管支架材料的制备及其生物学性能的研究[D].重庆:重庆大学,2012.[8]范仲雄,智丽丽,郭富强,等.镁合金在植入医疗器械中的应用进展[J].国际生物医学工程杂志,2015,38(4):242-246.[9]郭莉莎,何永辉,王娟,等.生物可降解Mg-2Zn-0.2Mn合金的体外生物相容性[J].材料科学与工程学报,2013,31(5):703.