葡萄酒中14种单体酚的高效液相色谱测定_韩国民

180 2011, Vol. 32, No. 02 食品科学 ※分析 葡萄酒中 14 种单体酚的高效液相色谱测定 韩国民 1，陈 锋 1，侯 敏 1，王 华 1 ,2 ,* (1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程研究技术中心，陕西 杨凌 712100) 摘  　要：建立一种新的、同时测定葡萄酒中 14 种单体酚含量的高效液相色谱法。采用 ZORBAX SB-C 18 色谱柱 (4.6mm × 250mm，5μm)，乙腈 - 冰醋酸 - 水溶液为流动相，梯度洗脱，流速为 1.0mL/min，柱温 30℃，检测波 长 280nm。测定 6 种不同地区、不同年份的赤霞珠干红葡萄酒中 14 种单体酚的含量。结果明，不同地区相同 品种葡萄酒中没食子酸、儿茶素、表儿茶素 3 种单体酚含量均较高，但 14 种单体酚含量各不相同，同地区不同 年份的赤霞珠葡萄酒单体酚含量亦有差别，葡萄酒中几种主要单体酚随时间的变化含量均有降低，同时伴随着部分 单体酚含量的增加。 关键词：高效液相色谱；葡萄酒；单体酚 Determination of 14 Mono-phenols in Dry Red Wines by HPLC HAN Guo-min 1，CHEN Feng 1，HOU Min 1，WANG Hua 1,2,* (1. College of Enology, Northwest A & F University, Yangling 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China； 712100, China) Abstract ：The contents of 14 mono-phenols in six Cabernet Sauvignon dry red wines with different aging times or different geographical origins of grape were determined using a HPLC method. The chromatographic separation was performed on a ZORBAX SB-C18 column at 30 ℃ with an acetonitrile/acetic acid/water mixture as a mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 280 nm. The contents of 14 mono-phenols in Cabernet Sauvignon wine varied with geographical origin of grape, and higher contents of gallic acid, catechin, and epicatechin were found in all the six wine samples. Cabernet Sauvignon wines with different aging times from the same region differed in their mono-phenols content as well. The contents of several major mono-phenols decreased with increasing aging time, while a few others exhibited an opposite change. Key s： HPLC；wine；mono-phenols；aging time；origin 中图分类号：TS201.2 1.3.2 色谱条件 由图 1 可知，采用梯度条件Ⅰ时，香草酸和咖啡 Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱(4.6mm × 250mm， 5μm)，紫外检测波长为 280nm，柱温 30℃，进样量 10 μL ，以峰面积外标法定量。梯度洗脱：流动相 A ： 水 - 冰醋酸(98:2，V/V)，流动相 B：乙腈，流速为 1mL/ min。洗脱程序：0～20min，B 为 3%～5%；20～35min， 酸两种单体酚不能较好的分离，梯度条件Ⅱ中，降低 0～20min 乙腈体积分数，延长第二梯度洗脱时间，在 不影响其他单体酚分离程度的前提下，香草酸和咖啡酸 得到了较好的分离(图 2)。由此，选取梯度条件Ⅱ为洗 脱条件，该条件有利于 1 4 种单体酚的精确测定。 B 为 5%～15 %；35～50min，B 为 15%～30%；50～ 65min，B 为 30%～30%；65～75min，B 为 30%～0%。 1 8 a 1.3.3 溶液的配制 分别称取没食子酸等14种单体酚9～11mg移至10mL 棕色容量瓶中，色谱甲醇定容，封口，作为混合标准 母液，将此标准液稀释成不同浓度梯度的标准溶液， 2 10 3 5 4 20 6 7 30 9 10 40 11 50 12 60 13 14 70 － 3 0 ℃保存备用。 时间 /min 182 2011, Vol. 32, No. 02 食品科学 ※分析检测 1 3 b 相对标准偏差较低(3 % 以内)。结果表明，乙酸乙酯可 用于高效萃取葡萄酒种单体酚，方法精密度高，符合 HPLC 测定要求。 2 4 5 67 8 9 10 11 1213 14 表 2 14 种 单 体 酚 精 密 度 和 加 标 回 收 率 实 验 结 果 (n=6) 10 20 30 40 50 60 70 Table 2 Precision and recovery tests for 14 pheolic acids (n=6) 时间 /min 单体酚 样品含量/(mg/L) 添加量/(mg/L) 测定量/(mg/L) 相对标准偏差/% 回收率/% 没食子酸    45.4        50        89.6        1.87      93.92 1 .没食子酸；2 . 安息香酸；3 . 儿茶素；4 . 香草酸；5 . 咖啡 酸；6 .丁香酸；7 .表儿茶素； 8 .香豆酸；9 . 芦丁；1 0 .水 杨酸；1 1 . 香豆素 1 2 .白藜芦醇；1 3 . 桑色素 1 4 .槲皮素。 图 2　 采 用 流 动 相 Ⅱ 条 件 下 14 种 单 体 酚 标 准 样 品 (a)和 葡 萄 酒 样 品 (b)的 色 谱 图 Fig.2 Chromatogram of 14 mono-phenol standards (a) and wine samples (b) under the second gradient program 安息香酸 儿茶素 香草酸 咖啡酸 丁香酸 表儿茶素 香豆酸 芦丁 水杨酸 3.8 29.8 5.4 12.9 4.9 23.4 8.5 4.9 10.4 52.6 48.8 51.5 50.4 50.65 54.2 51.1 50 50.3 48.5 72.99 52.3 58.12 52.03 69.37 51.93 50.04 55.38 0.67 1.23 0.54 0.66 2.83 0.95 1.08 0.97 1.25 85.99 92.86 91.91 91.82 93.66 89.39 87.13 91.15 91.24 2.3 标准曲线的制备 分别配制 10～360mg/L 6 个不同质量浓度的 14 种单 香豆素 白藜芦醇 桑色素 2.2 5 4.3 50.6 51.15 50.5 50.69 48.35 51.01 2.38 0.89 2.97 96 86.11 93.08 体酚混合标准溶液，进样 10μL，按上述确定的色谱条 槲皮素 10.2 50 51.35 1.74 85.3 件进行测定，以峰面积(Y )为纵坐标、质量浓度( X )为横 坐标，计算得到 1 4 条标准曲线，结果见表 1 。由表 1 2.5 标样和样品重复性实验 可知，没食子酸、儿茶素等 14 种单体酚标准品质量浓 度和相应峰面积呈良好线性关系，最低检测限(RSN=3)时 亦较低，表明此法灵敏度较高。 表 1 14 种 单 体 酚 保 留 时 间 、 回 归 方 程 和 检 测 限 Table 1 Retention time, regression equations, and detection limits of 14 phenolic acids 取同一批次的混合标准样品和葡萄酒样品，连续测 定 6 次，结果见表 3 。从表 3 可以看出，各单体酚保 留时间和峰面积的重复性较好，14 种单体酚保留时间的 相对标准偏差均在 2% 以内，峰面积的相对偏差均在 3% 以内。 表 3　 标 样 和 样 品 测 定 重 复 性 实 验 结 果 (n=6) 单体酚 保留时间/min 线性范围/(mg/L) 标准曲线 相关系数(r) 最低检测限/(mg/L) Table 3 Reproducibility tests for standard and sample determination 没食子酸 5.36 10～350 y=17882x－302711 0.9994 0.0223 (n=6) 安息香酸 儿茶素 香草酸 咖啡酸 丁香酸 表儿茶素 香豆酸 芦丁 水杨酸 香豆素 白藜芦醇 桑色素 槲皮素 9.79 20.56 26.43 27.25 31.7 33.07 37.39 46 48.36 55.27 62.66 65.6 70.74 10.56～368.2 y=9766.2x－182286 0.9994 10～341.6 y=4280.2x－79096 0.9995 10.02～350 y=10634x－219985 0.999 10.24～352.8 y=18976x－341675 0.9994 10.39～354.55 y=17857x－318002 0.9994 10.52～379.4 y=4204x－85701 0.9995 10.66～357.7 y=27226x－479951 0.9993 10.05～350 y=4641.9x－56887 0.9995 10.18～352.1 y=3441.3x－78908 0.9994 10.36～354.2 y=25661x－458099 0.9994 10.69～358.05 y=21192x－375172 0.9993 10.3～353.2 y=5255.1x－145555 0.9995 10.2～350 y=5707x－139844 0.9991 0.0352 0.042 0.0311 0.0456 0.0361 0.0287 0.0238 0.0422 0.0328 0.0301 0.0232 0.0297 0.0266 单体酚 没食子酸 安息香酸 儿茶素 香草酸 咖啡酸 丁香酸 表儿茶素 香豆酸 芦丁 水杨酸 香豆素 白藜芦醇 混合标样 RSD/% 保留时间  峰面积 0.89        0.23 1.2        0.18 1.86        0.28 0.92        0.36 1.19        0.18 0.82        0.56 0.76        0.33 0.64        0.27 0.69        0.43 0.71        0.24 0.69        0.21 0.42 0.19 葡萄酒样品 RSD/% 保留时间  峰面积 0.35        2.24 0.26        1.98 1.47        1.36 0.15        2.35 0.18        2.87 0.1        1.83 0.1        1.24 0.07        1.55 0.05        2.82 0.09        2.11 0.12        2.13 0.06 0.98 2.4 精密度和加标回收率实验 桑色素 槲皮素 0.29 0.33 0.26 0.17 0.05 0.03 1.77 0.89 向已知 14 种单体酚含量的葡萄酒中定量添加混合标 准液，按照 1.3.1 节方法制备葡萄酒样品(n=6)。10μL 进 2.6 葡萄酒样品的测定 样，根据测定结果中 14 种单体酚的含量分别计算相应的 精确度和回收率，结果见表 2 。由表 2 可知，没食子 酸、儿茶素等 14 种单体酚的回收率均在 85% 以上，且 根据前述色谱条件，对云南香格里拉赤霞珠干红 (2008)、四川九寨沟赤霞珠干红(2008)、宁夏贺兰山赤 霞珠干红(2008)、新疆新天赤霞珠干红(2009)、新疆新 ※分析检测 食品科学 2011, Vol. 32, No. 02 183 天赤霞珠干红(2008)、新疆新天赤霞珠干红(2007)6 种不 同地区、不同年份、相同品种的葡萄酒中 14 种单体酚 含量进行了测定，结果见表 4 。 单体酚含量之间的关系，还有待于今后进一步的研究。 参考文献： 表 4　 葡 萄 酒 中 各 单 体 酚 含 量 的 测 定 [1] 温鹏飞, 陈建业, 黄卫东. HPLC 法同时测定葡萄酒中 5 种黄烷 -3- 醇单体的研究[J]. 中国食品学报, 2006, 6(3): 133-137. Table 4 Mono-phenol contents in 6 different wines mg/L [2] [3] 李华, 王华, 袁春龙, 等. 葡萄酒化学[M]. 北京: 科学出版社, 2005. 王美丽, 吴鲁阳, 张振文, 等. HPLC 法测定不同葡萄品种成熟过程 单体酚 没食子酸 安息香酸 儿茶素 香草酸 咖啡酸 丁香酸 表儿茶素 香豆酸 芦丁 水杨酸 香豆素 白藜芦醇 桑色素 槲皮素 1# 45.4 3.8 29.8 5.4 12.9 4.9 23.4 8.5 4.9 10.4 2.2 5 4.3 10.2 2# 35.4 4.8 25.8 4.5 4.3 4 23.5 3.5 2.9 4.9 2 3.8 3.2 8.8 样品号 3# 26.8 3.1 28 4.1 11.6 3.8 23.4 7.1 4 16.8 2 3.8 3.9 10.9 4# 55.2 3.4 79.5 4.4 6.8 4.3