几种真菌的分离与鉴定

常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha） 真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子 生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。 （2）关节孢子：菌丝断裂形成长方形两端略钝圆的孢子叫关节孢子。如白地霉和粗球孢子菌。 （3）孢子囊孢子：为鞭毛菌和接合菌的无性生殖形式。孢子囊中所含的孢子来源于分枝菌丝或胞囊梗顶端膨大形成孢子囊，囊内原生质浓缩集聚，割裂而成，一般数目较多，孢子囊形态多样，因种而异。 （4）芽生孢子：由菌细胞出芽生成，见于念珠菌及隐球菌，前者（类酵母菌）出芽后孢子伸长呈丝状，但不见与母细胞分离，称为假菌丝，在假菌丝上的收缩点也可出芽成芽生孢子。 （5）分生孢子：是子囊菌和半知菌的无性孢子，也是半知菌分类的主要依据，单细胞的分生孢子称小分生孢子，有蒂或无蒂，侧生或游离，分散或成群，圆形、梨形、卵圆形或其它形状，表面粗糙或光滑，或有或无各种纹饰。多细胞的分生孢子称大分生孢子，有纺锤形、棒形、球棍形、镰刀形及其它形状，两端尖或圆或一端圆，厚壁或薄壁，壁光滑或粗糙，有色或无色，分隔有多有少。 （二）培养特性及繁殖方式 1．培养特性 大多数真菌对营养要求不高，只需要水、盐，简单的氮源及碳水化合物就可生长，一般常用沙堡氏琼脂基（主要成分葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂2%）培养都能生长。但需要弱酸性（pH 4～6）、较低孵育温度（22～28℃），充分温度和氧气供应才能生长良好。侵害内脏的某些真菌在37℃含血的培养基中生长良好。真菌生长都比较缓慢，大多需孵育数天后才成明显菌落，菌落有下列三种类型： （1）酵母型菌落：外观湿润稠软致密，类似一般细菌菌落，镜检只见有圆形或椭圆形生芽细胞（例如隐球菌的菌落）。 （2）类酵母型菌落：外观性状似酵母型菌落，镜检除见有出芽的细胞外，尚可见到假菌丝（例如念珠菌的菌落）。 （3）丝状型菌落：由多数分枝的菌丝体向上生长组成疏松的绒球状，表面有很多孢子，显示各种色泽，菌落可呈棉絮状 绒球状 粉末状或石膏样，其正面和背面可显示各种不同色素，常作为鉴定菌种的参考。镜检可见有纵横交织的菌丝及各种孢子（例如各种癣菌的菌落）。 2．繁殖方式 有多样性，包括出芽增殖，菌丝增长，菌丝分枝和断裂，产生无性孢子及有性孢子进行繁殖，因此它繁殖力很强，但生长速度较慢。 （三）变异性和抵抗力 真菌很容易发生变异，在人工培养基中多次移种或孵育过久，就可出现形态结构、菌落性状、色素以及各种生理性状（包括毒力）的改变，用不同的培养基和温度培养真菌，其性状也有改变，真菌对干燥阳光紫外线及一般化学消毒剂耐受性却较强。但对热的抵抗力却不强。60℃以上1小时即可杀死孢子及其菌丝，在1%～3%石炭酸、2.5%碘酊、0.1%升汞及10%甲醛中可被灭活。用甲醛气体熏蒸被真菌污染的衣物用具，可杀灭真菌菌丝及其孢子。但真菌对一般抗菌素及磺胺药均不敏感。只对二性霉素、酮康唑、制霉菌素等非常敏感，治疗真菌感染常用此药。 （四）致病性与免疫性 1．致病性 病原真菌的致病机制还是一个未完全解决的问题；根据其侵害部位，主要分为下列两类： （1）浅部真菌病：主要由癣菌引起，大多为外源感染，常易侵害皮肤、指（趾）甲及须发等含角质的组织，引起癣症。 （2）深部真菌病：可由各种真菌引起，包括类酵母菌、二相真菌及丝状菌。侵害粘膜、皮下组织、内脏及脑膜等处，有时扩散全身，主要是内源性感染，也可由外源传染；前者是因机体抵抗力降低，如患重病，长期使用免疫抑制剂，广谱抗菌素或放射治疗，患恶性病，严重烧伤等时，造成体内菌群失调，以致常居在体内的某些真菌（如白念珠菌），甚至平时不致病的环境中的真菌（如曲霉、毛霉）等也会乘机侵害，一些传染性较强的内脏真菌病是内外源感染。 2．免疫性 浅部真菌病一般在血中不产生特异性抗体，病后无免疫保护力，只是儿童头癣等青春期后头皮皮脂增多时可以自愈，以后不再感染，其他部位癣症治愈后仍可再感染。深部真菌病虽可产生抗体，但无明显免疫保护作用。 临床常见的病原性真菌 一、 浅部真菌 （—）皮肤癣菌 皮肤癣菌又称皮肤丝状真菌，有下列三属（见表1），都只侵犯体表角化组织（皮肤，毛发及指甲和趾甲）。不侵害深部组织，或内脏，皆属外源性传染，由接触患癣病人、动物（狗、猫、鼠、牛、马等）或染菌物体而感染。 1．毛癣菌属  ＊红色毛癣菌 （1）直接镜检：皮屑及甲屑，分枝分隔的菌丝有时可断裂或关节孢子状，毛发：发外型感染表现为发外孢子排列成串。少数为发内型感染孢子在发内排列成链状；毛发穿孔试验阴性。 （2）培养特征：在葡萄糖蛋白胨琼脂，25℃，生长比较快，菌落形态有多种表现，镜检也不完全一样，常见有下列四种：I型：羊毛状：白色羊毛状菌丝充满斜面，典型的卷成筒状，边缘贴牢管壁，呈鲜红色，背面开始在中心有一红色小点，以后形成深红色环，最后成片为葡萄酒色，色素边缘划界非常明显。少数I型菌株表现无红色色素，正面白色，背面呈淡黄色类似石膏I型，亦有正面白色而背面呈灰黑色。II型：绒毛状：粉红色绒毛状菌丝生长，占斜面3/5，菌丝稀疏，透过菌丝可见粉红色的基底，背面颜色同I型相同。III型：粉未状：菌落表面稍有凸起，呈粉末状，粉红色，约占斜面的1/2～2/3，背面同I型。IV型：沟纹状：菌落生长相对较慢，比以上三种类型为小，占斜面的1/3～1/2，菌落中央凸起，从中央向四周有排列比较整齐的放射状沟纹，边缘整齐，表面菌丝甚少。开始微带黄色，以后变粉红，背面同I型。 （3）菌种鉴定：①菌落特征及色素；②大小分生孢子的形态；③玉米粉吐温琼脂上产生红色色素；④毛发穿孔试验阴性；⑤尿素酶试验阴性。 ＊须癣毛癣菌 （1）直接镜检：皮屑内见分枝分隔的菌丝，甲屑内为关节状菌丝。毛发感染为发外型，发内有时有菌丝。 （2）培养特性：在沙氏上生长较快，菌落形态可分为两大类：毛型和粉型；下列I、II型为毛型，III、IV、V型属粉型。自炎症明显的皮损中所分离出的菌株多属粉型。毛型菌落外观均似红毛，应注意鉴别。具体分型①羊毛状（I型），又称趾间毛癣菌，菌落生长快，白色羊毛状。气生菌丝较多且长，排列紧密，充满斜面，好象红毛，正面雪白，背面淡黄色。镜检见较细分枝，分隔的菌丝，胞浆浓。有少量球形或长形小分生孢子，无螺旋菌丝和大分生孢子。间或可见球拍菌丝及结节菌丝。②绒毛型（II型），生长快，菌落雪白。表面有紧密的细短气生菌丝，中央可有乳头状突起，边缘如刀切，背面棕黄色或棕红色。镜检见较细的分枝、分隔的菌丝，小分生孢子多，有时成葡萄串状，无螺旋菌丝或大分生孢子；③乳皮状（III型），开始为乳白色菌丝，不久一部分菌落变为粉末样，色微黄，光滑，似牛乳表面的一层薄膜，可一块块地挑取，中央有少许褶叠，边缘不整齐，背面淡黄或棕黄色。镜检见粗细不一，分枝分隔的菌丝和大量螺旋菌丝，间或可见破梳状菌丝，结节菌丝及球拍菌丝，大分生孢子少，棒状，两端圆，与分生孢子梗的连接处较窄，薄壁光滑，小分生孢子多，球形或长形，有时成葡萄串状排列。④粉末状（IV型），菌落粉末状，表面平坦、光滑。间或有少数白色气生菌丝，中央有乳头状凸起，边缘锯齿状。菌落生长快，充满斜面，色黄或奶油色，外观像石小、背面棕黄或棕红色。⑤颗粒状（V型）：生长快，菌落粉样，表面不平，呈颗粒状。有不规则的褶叠或沟纹，边缘不整齐。下面色黄带红或棕黄。背面棕红色。IV、V镜检均见大量棒状大分生孢子及无数圆形的小分生孢子，少数长型。游离或葡萄状成串，有螺旋菌丝和球拍菌丝。 （3）菌种鉴定：①菌落形态；②菌丝较细，是皮肤癣菌中最细的一种；③螺旋菌丝多见；④大分生孢子的形态和球形小分生孢子；⑤尿素酶阳性；⑥毛发穿孔阳性。 ＊紫色毛癣菌 （1）直接镜检：皮屑、甲屑内可见分枝分隔的菌丝或成串的孢子，病发取黑点部位的断发，毛发损害为发内型大孢子，呈关节型排列，充满整个发内，故毛发出皮即断。 （2）培养特性：在沙氏琼脂培养基室温培养菌落生长慢，开始为圆形、白色、潮湿发亮的菌落，类似酵母；以后中央褶叠或突起，产生紫色色素，并逐渐扩大，或中央紫色，边缘淡红色，最外围有一圈白色的环。培养基颜色不变，边缘无放射状菌丝，整齐如刀切，下沉不明显，背面无色至深紫色，少数菌株无颜色，呈无色紫色毛癣菌，镜检见粗细不一的菌丝，分隔较密，胞浆淡，有很多不规则的突起和肿胀，但无鹿角菌丝。厚壁孢子多，多为间生，偶见小分生孢子2～5个大生分生孢子。 （3）菌种鉴定：①菌落形态，紫色色素；②VitB能促进菌落生长，形成大分生孢子；③发内型感染。 2．小孢子菌属 ＊羊毛状小孢子菌 （1） 直接镜检：皮屑内见分枝、分隔的菌丝，病发为发外型感染。 （2）培养特性：在沙氏琼脂培养基上室温生长快。开始为黄色绒毛样生长，2周后菌丝较多，呈羊毛状，可充满大部分斜面。中央趋向粉未化。正面桔黄，背面红棕色，平皿中培养的菌落表面中央可有少数同心园，无放射状沟纹。生长约4-5周后开始变异，菌丝增多，大分生孢子减少或消失。镜检见大量纺锤形，厚壁的大分生孢子。一端稍弯曲，末端有帽样肥大，有6-15个分隔。小分生孢子较少，长形，无柄侧生。可有球拍状菌丝，破梳状菌丝，结节菌丝及大量厚壁孢子等。 （3）菌种鉴定：①菌落形态及色素，在PDA培养基上能产生黄色色素；②特征性的厚壁、顶端膨大微弯曲，如戴帽的大分生孢子；③发外孢子型感染。 ＊石膏样小孢子菌 （1）直接镜检：皮屑内见菌丝或成串的孢子，病发为发外型感染，孢子较大，排列成串。 （2）培养特性：在沙氏琼脂培养基上室温生长快，开始为白色菌丝，后成棕黄色粉未状菌落，凝结成片，菌落中心有隆起，外围有少数极短的沟纹，边缘不整齐，背面红棕色。镜检：见多数较小，纺锤形，4～6个的大分生孢子，壁厚1～3μm，两端园，壁有刺，菌丝较少，小分生孢子棒状无柄，有时可见球拍状菌丝，螺旋，破梳状菌丝及结节菌丝。