凝结芽孢杆菌牙孢形成注体培养基的研究

凝结芽孢杆菌牙孢形成注体培养基的研究 予O A 凝结芽孢杆菌芽孢形成液体培养基的研究 . l 篆7 摘要一一 本文对,株具有疗效作用的同型乳酸发酵蓖—凝结芽孢杆菌TQ33的产芽孢培养基进 行了研究该菌株在普通液体培养基中通常不形成芽孢,丽在所设计的一种含 Mn53ppm)l~液体培养基中,可产生75x10CFU/m】以上的芽孢(活菌计数),占 一 前言 本院微生物教研室采用Kitahara&Suzuki培养基",从脱脂奶粉中分离到一株同 型乳鲛酵的凝结芽孢杆菌TQT3.熔谚翦的芽孢作为活性园子经小范隧的人体服用试 验,明,它对常见的肠道疾霸扣:幔性结肠炎,腹蔼与便秘等均宵明显的疗效.与普通 乳酸菌相比,TQ33的优势在于能形成耐热性和耐酸性较强的芽j.固而适合于向需要加 热的食品和酸性食品中掭加,并且,其芽孢作为活性因子耐受胃酸顺利到达肠道并定植存 恬的能力也较强.. 虽然TQ33在多种固体培养基上形成芽孢良好,但在普通液体培养基中却不能形 成芽 孢.由于固体培养的局限性必将妨碍其扩大生产及实际应用,因此,寻找适合TQ33的液 体培养产芽孢条件,对实现该菌制弃葺的工业化生产具有重要的现实意义. 与方法 1茁种 凝结芽孢杆菌TQ33(BaeillusCoagulansTQ33),本院徽生物教研室分离. 2培养基 TQ33芽孢形成液体培养基:酵母膏lg,蛋白胨lg,MnSO.0.005g K2HPO402g,葡萄糖O,6g,MgSo?7H2o0tg,蒸馏水100ml,pH7,O. 麸皮琼脂培养基:蛋白胨2.酵母膏0.,葡萄糖O.2昌,琼瞻2昌,麸皮水100ml pH7,0,7,.(麸皮术:5g麸皮加水100ml,小火煮沸lhr,纱布过滤.) 92级硕士研究生 一 24— 麸皮液体培养基:除不加琼脂外.成分同麸皮琼腊培养基. 淡薄培养基,玉米耪—酵母膏培养基,TAM培养基.'.加淀耪的TAM培 养基?,芽孢形成培养基,补充锰的营养琼脂培养基.普通营养琼脂培养基, Nakayama培养基. 3方法 (1)培养条件- 固体培养基上芽孢形成的培养:取一环斜面活化菌种接人5ml麸皮液体培养基中? 加?静置培养24小时.取0.5ml培养藏涂布于待测芽孢形成固体培养基上.4012培养. 液体培养基中芽孢形成的培养:取一环斜面活化菌种接人"r033芽孢形成液体培养基 中.'250ml三角瓶装15--50ml培养基,40-5012振荡培养(140rom)或静置培养. (2)总菌数及耐热芽孢敷的滔定 采用淡薄培养基,以平扳菌落计数法,经4012培养48hr,测出培养菠的总菌数.耐 热芽孢数的测定,是将培养藏经8012加热处理l0分钟,以平板活菌计数法涓出培养液的 耐热芽孢数. 结果与讨论 (一)固体培养基上芽孢形成的理察 对多种固体培养基进行了产芽孢实验.结果见表1. 表jT(233在不同固体培养基上芽抱形成情咒 培养菠薄TAMTAM+麸皮普通营营养琼玉米磅芽孢形成 时间 01r】培养基淀柑培养基养琼脂目旨+Mn酵母膏培养基 18 20++ 37+++++++ 44+++++++-I-+-I-+ 136+-I-+++? 注:一表示无芽孢;有个别芽孢;十+表示有少量芽孢(<10%】:卅表示有大量芽孢; /未观察 一 25— 曲表l可看出TQ33产芽孢最适台的固体培养基有:淡薄培养基.TAM培养基, 加淀糟鼬砌培养基补充锰的营养琼脂培养基.其次为麸皮琼脂培养基及玉米粉酵母 膏培募基Q鹞在芽成培养基上不产芽孢. I溘基中芽鑫形成的难察 幕册同配方(除不忝加琼脂_外)的镀体培养基及Nakayama 发理TQ33在TAM液体培养基中,通过振荡培养,能产生大量 芽氇其髫热芽程搜可达息蓖敦的1%.而在其它几种禳体培养基中,无论是静止培养 步设计 栗册TAM培番基,可影成一定量的芽孢.照实验的再现性较差.调整TAM培养基 皱分.跛厢其它氢鞭以代替TAM培养摹中的酥蛋白胨.发现,用蛋白胨代替胼蛋白胨, 俚籀藏耨一囊量的芽密,面且实验重复性好.因此,初步确定TQ33芽孢形成液体培养 基组成靠:噩自矗0.5%.酵母膏o.5%.葡萄精0.3%,K2HPO.01%. M蛾哪mM~SO4?7H200.05%. 3凌倦磕葬基备组分封芽孢形成的影响 对芽猫形成的影响,选用正交表L.I(3T),进行六因素三水 平正交试验.潮疰舶?振葫培养72hr发簿液的总菌敷及芽孢效.实验设计及结果分析见 袁3及 袁因素与术平表 ABCD-EF 解羞自墨蜀璃 %)葡萄糖'%)J(P0.(%)MrtSO4(ppm)MgSO4?7H) I?ojn6O0005 2I5O玑3ID.1500 ,I且lO0.2l?O.1O 一一 表3LM正交试验设计及试验结果表 耐热芽孢数/总菌数 )( 试验号ABCDEFG(空白 %) —— l00506000.050 2000.30.1500O 3O1OOO210oO.11.22 40.50.50.60.1500l292 5O5OO.30.2tO00.05O 60.51.000000 7L005030lOO00 8I_0000.100l0 9l0l00602500.05377 l000.50025007.75 llO00.60l000l0 l201.0030l00.0503 t l30.50.5030200.1l032 L 140.5000500050 l50.5l0060.1l000l00 l6l00500.1l000.050 I7I_000.60.2000 l8ll0l00.30500.12ll3 I.9.2720.9950.622ll3l0.6238 :9l34 ?.23.24031.75l3.22695l7 P:4635 ?,588370358.975699ll223559 Q681.17898.28608.48644.85844.82504.29 S2l7.67434.78l44.98181.3538l_3240.79 1 — 27— 氟4Ll8(37)亩差分祆姥采 方差来源平方和自由度均方F显着性 A2l7672108.84l舟5a ? B434.782217j9370() E38l32l9066324() Cl44982一,, Dl8l_]52 \115883 t F40792 误差28005 总和l68094l7 注:()表示影响较显着;?表示有,定影响 从方差分析结果看,对于TQ33芽孢的形成,酵母膏(B),MnSO(E)有较显着的 影响,蛋白胨(A)有一定的影响,葡萄塘,K:HPO,MgSO.影响很小.在实验范围 内,前三种物质的最c托水平组合为B3E:A,后三种物质原则上可任意取值,本实验取它 们三个水平中的最大值.因此,TQ33芽孢形成液体培养基的最佳配方确定为: 酵母膏1.0‰,MnsO50ppm,蛋白臁1.0%,葡萄糖0.6%,K,HPo.0.2%, MgSO4?7H2O0.1%. 关于Mn能否促进芽孢的形成,曾有不同的报道.Rowe"(1975)认为.Mn不是 嗜热脂肪芽孢杆菌形成芽孢所必需的微量元素;而Anderson"(1972)和Cheung (1982)的研究结果与此相反.本实验结果是,Mn具有促进TQ33形成芽孢的作用,与 Yokata".(1981)的结论相一致.Yokata曾报道,Mn髓促进Bacillus属的野生株及舞 变株形成芽孢,并合成D一葡萄糖脱氢酶(D—glucosedehydrogenase,GLD).GLD是一种 只与芽孢形成有关的酶,存在于前孢子中,目前尚未在母细胞中发现.GLD的合成,被 认为是芽孢形成过程中一系列生化反应的特征之一 (三)温度和通风量对芽孢形成的影响 ,对 取40,45,50U三个温度及250ml三角瓶装液量15,25,35和45mi的条件TQ33进行产芽孢实验.经振荡培养(140rpm)72hr,测定发酵液的总菌数及芽孢数,结 果见表5,67. 一 28— 表椰?时,通风量,}芽孢形成率的影响 装液羞(m0苴iiBIIICFU/mn芽孢数(cFu/m1)芽孢鼓/总菌虹%) 152.4xl0I2.5x10~10.4 251.9xl0t2.7×lo7l4.2 352.0xl0t3. 0×l0l5.0 451.7×l3.5×10,206 表6?时,通风量对芽孢彤成率的影响 装蕞量(ra1)总iIIt(CFU/ml】芽孢数(CFU/m1)芽孢敷/总菌数(%) 151.9xl0t42×1022_1 251.9×10t44×1023.0 351.7×Io*4. 5×107270 451.6xl0l5.0xl3l_O 袁75o'c时,通风量对芽孢形成率的影响 装}直量(珈I)甚iI~CFO/m1)芽孢数(CFU/m1)芽孢数/总菌数(%) l51.9xl4.5×l01240 251.8xl4.9×1027.2 351.6xl矿53×107331 45Ij×zo*75x10577 表中结果说明,温度对TOIl的芽孢形成有着显着的影响.在40,50?,TQ33的芽 孢形成率随着温度的升高面增加.40和45E时,芽孢形成率较低,菌体主要以营养体形 式存在:而50E:时,芽孢形成率可达到57.7%.表中数据还说明,通风量对TQ33的芽 孢形成有影响,TO33的芽孢形成率随通风量的减小而提高.在5O?,装液量由35m1变 为45ml时t芽孢形成率由33.1%提高到57.7%.以上结果说明,在较高的温度和通气不 良的条件下,芽孢杆菌属的缩酋以形成芽孢形式抵抗不良环境而生存.为此,选择 50E:,装液量45ml,作为T033产芽孢的最适条件. (四)TO33在芽孢形成培养基中的生长及芽孢形成曲线 TO33在形填芽孢的最适条件.F,以时闻为横坐标,总菌数,耐热芽孢数,pH值为 纵坐标,得到圉1.从图中曲线看,在菌体生长的对数后期,耐热芽孢数迅速增加;进入 稳定期后,芽孢敦量增加缓慢.60hr时,芽孢数达到最大值(88×l0CFU/rnD, 总菌敦的52%,之后,芽孢敦基本保持变.在菌体生长的前12hr,pH值变化很小, 12~24hr间,pH值迅速上升至7.4,之后变化不太,72hr时,pH值为7.5. 29— 图JTQ33在芽孢形成液体培养基中的生长及芽孢形成曲线 l一盛苗数卜耐热芽孢鼗3—啦i值 结'论 凝结芽孢杆菌TQ33在本文所设计的芽孢形成液体培养基中进行培养.耐热芽孢数可 达8.0×10CFU/ml为总菌数的52%.Mn2+对TQ33的芽孢形成有明显的促进作 用,在不含Mn"的液体培养基中.TQ33不形成芽孢. 主要参考文截 (1)Doores,S.,Westhorr,D.,Journalo1"FoodScience,1981,46:~310--812 (23卢振祖,细菌分类学,武汉大学出版社,1994 (33Hamond,MEL—B.,Lechowich,R.V.,Amaha,M.,e【.,Joumaloi"Food Science,1963,27(3):219-231 (4)(日)根井外喜男编,金连缘译,微生物保存法,上海辩技出版社.1982 (53Felg,S.,Stersky,A.K.,JournalofFoodScience,1981,48(1):135--137 (6)l~akayamaTaigu,Jpn, KokaitokyoKohoJP5840,093(83,40.093) (73Rowe.J.J.,Gddberg,I,D.,Amehmten,R.E.,JournalofBacteriology,1975, 124:279-284 (83Andcrzon,R.A.,Friesen,W-T.,Austr矗h?JournalofPharma~utialSeiences NSI,"1972:1--6 (93Cheung,H.Y.,Vitkovic,L.V.,Brown,M.R.W.,JournalofGeneral Microbiology,1982,128:2395-2402 (103Yokata,A.,Sasiima,K.,Agric.Bio1.Chem.,1981,4s(11),2417--2423 — 30 ,/芷.u,奄