抗骨桥蛋白抗体防治内皮剥脱术后血管狭窄的实验研究

抗骨桥蛋白抗体防治内皮剥脱术后血管狭窄的实验研究 抗骨桥蛋白抗体防治内皮剥脱术后血管狭 窄的实验研究 ? 222? 第25卷第4期河北医科大学学报Vo1.25No.4 2004年7月J()URNAIOFHEBEIMEDICAlUNIVERSITYJuly2004 ? 研究快报? 抗骨桥蛋白抗体防治内皮剥脱术后 血管狭窄的实验研究 张永钢,韩梅,温进坤,程云会,刘智敏 (河北医科大学基础医学研究所,河北省医学生物技术重点实验室,河北石家庄050017) 【主题词】血管成形术,经腔,经皮冠状动脉;血管内膜;大鼠 【中图分类号】R543.3【文献标识码】B【文章编号11007—3205(2004)040222—02 经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminalcoronaryangioplasty,PTCA)后血管 再狭窄(restenosis,RS)是一个过度的创伤愈合过 程.血管中膜平滑肌细胞的增殖和迁移,细胞外基 质的异常积聚以及血管重塑是造成再狭窄的主要原 因.在RS的发病过程中,骨桥蛋白(osteopontin, OPN)的表达水平与血管损伤后内膜增生的程度明 显相关,并在其中发挥着重要的作用.基于OPN 的生物功能,我们利用本室制备的抗OPN多克隆 抗体,观察其防治内皮剥脱术后血管狭窄的治疗效 果,并初步探讨其机制. MMP-2及组织基质金属蛋白酶一2抑制剂(tissue inhibitorofmatrixmetalloproteinase-2,TIMP_一2) 的表达变化;分离白细胞,用流式细胞术检测细胞表 面黏附分子CD1la和CD11C的表达变化.分离胸 主动脉血管细胞,测量细胞表面细胞间黏附分子一1 (intercellularadhesivemolecule-1,ICAM一1)的表 达变化. 1.3统计学处理:应用SPSS统计软件对实验数据 进行统计学处理,实验结果以(?S)表示;在方差 齐性检验之后利用t检验进行组间数据差异显着性 分析. 1材料与方法2结果与讨论 1.1动物模型的建立及分组:采用8月龄健康雄性 SD大鼠(体质量500,550g),建立颈总动脉一主动 脉联合内皮剥脱后内膜增生的动物模型.实验动物 分为两组,分别为治疗组(一5)和对照组(一4). 术后当天治疗组大鼠经尾静脉注射兔抗大鼠OPN 抗血清,对照组给予正常兔血清,每次0.5ml,每隔 2d给药1次,共给药7次. 1.2实验标本的处理:术后21d时,经右侧颈总动 脉放血处死大鼠,收集血液,左颈总动脉及主动脉标 本.取颈总动脉中段血管病理切片,HE染色观察 血管壁的增生情况并进行形态测量分析;提取主动 脉总蛋白,明胶酶图分析检测血管组织中基质金属 蛋白酶一2(matrixmetalloproteinase一2,MMP一2)活 性的变化;WesternBlot检测血管组织中MMP一2 含量的变化;病理切片免疫组织化学染色观察其中 [收稿日期]200404—09;[修回日期]20040420 [资助项目]国家科技攻关计划课题(NO.2002BA755C);河北 省重大科技攻关课题(NO.022764050) l-~g者简介]张永钢(1977),男,河北沧州人,河北医科大学基 础医学研究所理学硕士研究生.从事心血管分子生物学研究. OPN是细胞外基质中的一种黏附蛋白,在血管 新生内膜形成过程中,OPN的表达水平与平滑肌细 胞的去分化,迁移,增殖以及细胞外基质的分泌密切 相关.本实验利用抗OPN抗体阻断OPN的功能, 观察其对血管内膜增生和基质代谢的影响.结果表 明,经抗OPN抗体治疗后,内膜剥脱的瑷总动脉管 腔内径较模型组增大(Pd0.05),瘸变减轻,内膜 增生受到明显抑制(P<0.05).该结果不仅证实 OPN直接参与了内膜增生过程,而且提示以OPN 为靶标的抗血管再狭窄策略是可行的. 在血管内膜增生过程中,黏附分子介导的细胞 黏附与迁移有赖于细胞外基质的降解,已知MMP一2 和TIMP一2是决定血管壁细胞外基质转换速率的重 要调节系统,具有与OPN相似的病理生理学意义, 通常二者的活性与细胞迁移和增殖速率具有正相关 关系.本实验发现,给予抗OPN抗体后,随着内膜 增生程度的减轻,其病变部位的MMP_2活性也呈 降低趋势.但WesternBlot分析和免疫组织化学 染色表明,MMP一2的表达水平与模型组无明显差 别.提示抗OPN抗体对于MMP一2的活化过程具 有抑制作用.TIMP一2作为MMP一2的内源性抑制 张永钢等抗骨桥蛋白抗体防治内皮剥脱术后血管狭窄的实验研究?223? 剂,目前发现其对MMP一2的活化既具有抑制作用, 同时又是MMP一2活化所必需的辅助因子,二者之 间的关系较为复杂.免疫组化证实,TIMP一2水平 与内膜增生程度无明显关系,在抗OPN抗体治疗 组和模型组之间,TIMP的表达也无差异. 血管内皮剥脱后,受损局部继发的炎症反应伴 随着各种炎症介质的释放.已有报道指出,活化的 单核/巨噬细胞可释放大量的OPN,后者可诱使循 环血液中白细胞募集到损伤部位.流式细胞分析显 示,抗OPN抗体对白细胞黏附受体的主要配体 ICAM一1的表达没有显着的影响,但可在一定程度 上下调白细胞黏附分子CD11a和CD1lc的表达(P <0.05).由此推测,OPN可能还具有活化白细胞 的功能. 总之,在血管内皮细胞剥脱后,不同细胞来源的 ()PN共同参与了内膜增生的整个过程.利用抗体 封闭特异蛋白是发现蛋白质的新功能的有效手段, 也是生物药物研发的思路之一.针对抗体结构进行 改造以削减除药物的不良反应(如免疫反应)将是我 们今后研发抗OPN生物药物的重点. 髋臼缘截骨血管束移植治疗成人髋臼发育不良并发股骨头坏死远期随访 (正文见第197页) 图5左髋臼发育不良并发股骨头缺皿性坏死术前像 Figure5Pre-operativeimageofleftaeetabulardysplasiacomplicatedwithischemicnecrosisoffemoral head 图6行髋臼缘截骨和旋股外动脉移植术后2年复查,股骨头包容率达100.关节间隙基本恢复正常,股骨头成活 Figure6Reexaminationat2yearsafteracetabularrimosteotomyandlateralfemoralcircumplexarterytr anspIantation:Coveragerateof femoralheadwas100.Thejointspacebasicallyreturnedtonormalandfemoralheadsurvived 图7双侧髋臼发育不良并发股骨头缺血性坏死,术前CT示:髋关节间隙变窄,股骨头变形,头内有囊性变 Figure7Bilateralacetabulardysplasiacomplicatedwithischemicnecrosisoffemoralhead.Pre—operativeCTshowed:Narrowedhip-jointspace anddeformedfemoralhead,cysticdegenerationwasseeninfemoralhead 图8术后2年CT示双侧股骨头包容增加.关节间隙增宽达3mm,囊性变消失,股骨头成活 Figure8At2yearsafteroperation,(,Tshowed:Increasedcoverageofbilateralfemoralheadsandbroaden edjointspace(3mm),cystic degenerationdisappearedandfemoralheadsurvived