高等植物叶片衰老及其影响因素

高等植物叶片衰老及其影响因素 高等植物叶片衰老及其影响因素的研究 徐小青 (陕西师范大学民族教育学院，陕西 西安，760012) 摘要 衰老是高等植物叶片生长发育进程中的最后阶段。衰老的产生将引起叶片 的一些生理变化，如蛋白质的丧失、叶绿素含量的减少、光合作用速率的下降等。 高等植物叶片的衰老是受环境因素(温度、水份、营养、光照等)和内在因素(激 2+素、多胺、Ca、自由基、基因等)共同影响的过程。 关键词 叶片衰老;生理变化;影响因素 Abstract Leaf Senescence is the last phase of higher plant development. Some physiological changes will be happened in leaf Senescence, such as the loss of protein, the reduce of chlorophyll contents, the drop of photosynthesis rate and so on. Leaf Senescence of higher plant is determined by both environmental (temperature, water, 2+nutrition, light and so on) and internal factors (Hormone, Polyamines, Ca, free radical, gene and so on ). Key words Leaf Senescence; Physiology changes; Affecting factors 1 前言 叶片是植物进行光合作用的主要器官，叶片的发育和衰老直接影响植物的生 长和产量。近年来，关于衰老叶片的生理变化及其影响因素的研究，在许多作物 中已取得丰硕成果。其中关于生理变化的研究，主要是以叶片的蛋白质含量、叶 [1]绿素含量和光合速率等作为测定项目。自20世纪60年代末，许多科学家开始 对影响高等植物叶片衰老的因素进行研究，这些因素包括由外部环境因素、激素、 自由基伤害学说、细胞程序性死亡对高等植物叶片衰老产生的影响等，并且这些 研究取得了很大进展。 2 高等植物衰老叶片中的生理变化 叶片的衰老从面上观察是由绿变黄，再到枯黄，最终脱落死亡的过程。其内部变化主要有蛋白质含量、叶绿素含量和光合速率等的变化。 2.1 衰老叶片中蛋白质含量的变化 蛋白质在成熟组织中是处于相对恒定的周转中，即合成的量等于分解的量， [2]因此细胞组织的稳定状态是由一种合成和分解的平衡系统所维持。但随着植物 [3]叶片的衰老，这种平衡被打破，表现为蛋白质的降解，并且降解的主要是可溶 [4]蛋白质中的部分?蛋白，也就是核酮糖二磷酸(RuBP)羧化酶。戴金平等观察报道证实了这一观点，植物衰老时，被水解了的蛋白质是植物进行光合作用的RuBP羧化酶，它是一个主要的叶片蛋白质组分。其他的酶及非结构蛋白也被水 [5]解。吴光南等指出，蛋白质降解是叶片衰老的基本特征。水稻叶片在抽伸过程中叶绿素和蛋白质含量均增加，抽伸完毕时达最高值，然后在衰老过程中下降， [6]证实了蛋白质合成和降解是叶片生长和衰老的基本特征。宋松泉等以水稻离体叶片试验结果也表明，随着离体叶片衰老的开始和进程，叶片中氨肽酶和内肽酶活性显著增加，因而导致蛋白质的水解作用加强，可溶性蛋白质含量下降。衰老 [7]过程中蛋白质水解酶的比活增加150,以上。Ray And Choudhur用整体水稻叶片试验结果证明，随着叶片衰老，蛋白水解酶的活力逐渐增加。但是，Biswas[8]等对整体水稻叶片研究结果发现，倒2叶和倒3叶蛋白水解酶活力并不与蛋白 [5]质含量下降成比例。吴光南等研究发现，虽然衰老过程中蛋白水解酶的比活增加，但其增加开始期落后于蛋白质含量下降开始期。这就是说蛋白质含量下降不仅仅决定于蛋白质水解酶活力一个因素，在蛋白质合成速率降低的情况下，即使蛋白质水解酶的活力不增加，蛋白质的含量也会下降。 在叶片衰老过程中，蛋白水解酶与基质接近程度的改变也可影响蛋白质的降解速度。Ryan等认为在正常情况下蛋白水解酶是在一定的区隔化条件下起作用 [9] [10]的，但在衰老过程中，它们被释放到细胞质起作用，促进蛋白质的降解。看来叶片衰老时蛋白质含量下降是蛋白质合成速率降低，蛋白水解酶比活上升和蛋 [11]白质水解酶在空间上与蛋白质接近程度改变的共同结果。陈贵等在研究丙二醛(MDA)与衰老指标时指出，在植物衰老进程中，蛋白质逐渐降解成氨基酸。例如在深度衰老的叶片提取液中加入茚三酮试剂检验表明，确实有氨基酸的存 [12]在。丁文明等用黄瓜子叶做材料研究报道，伴随着黄瓜子叶的衰老，子叶的 可溶性蛋白含量下降，子叶的主要几种游离氨基酸累积明显增高，其中尤以谷氨酸和精氨酸等最为明显。因为叶片衰老过程中蛋白质是逐渐稳定地下降，所以现 [13]在许多人都以蛋白质含量的多少来表示植物衰老的程度。 2.2 衰老叶片中叶绿素含量的变化 [14][15]许多研究表明，叶绿素含量和衰老之间存在明显的负相关。Leshem研究指出，叶片衰老最明显的表现就是叶绿素逐渐消失，并伴随着黄化以及叶片的 [16]最终脱落。聂先舟等报道水稻离体叶片随着离体天数的增加，叶绿素含量下降，衰老加深。从衰老过程中叶绿体超微结构的变化也可以看出叶绿体随年龄增加而逐渐解体。因而有人提出叶绿素分解是衰老的原发过程及衰老的真正标志。 [8]Biswas和Choudhuri研究水稻叶片衰老时指出，水稻叶片中叶绿素和蛋白质含量的下降可作为衡量水稻叶片衰老的可靠指标。水稻叶片衰老时，叶绿素含量下降，而且叶绿素a比叶绿素b下降的快，叶绿素a/b比值可作为衰老的一个指标。 [11]衰老程度越严重，叶绿素含量越低。大豆叶片衰老过程中叶绿体被膜上参与半乳糖酯合成并在膜上装配的半乳糖转移酶活性降低。在小麦中也发现，随着小麦叶片的衰老，叶绿素的破坏加强，且叶绿素a破坏率高于叶绿素b，衰老过程 2-中积累的超氧阴离子(O)能直接引发叶绿素的破坏及特异性地破坏叶绿素a， 2-致使叶绿素分解破坏和叶绿素a/b值下降。叶绿素a对O的反应较叶绿素b敏[17]2-感。另外还发现，随着叶绿体中O大量产生，类胡萝卜素(Car)先于叶绿素 2-(Chl)而被破坏，Chl/Car比值明显增大。O的产生与光合色素含量的降低及膜过氧化产物MDA含量的增加具有极显著的相关性。在经SO处理的叶片中形2 [18]成MDA的同时叶绿素a受到破坏。水分胁迫下甘蔗叶绿素含量的变化与MDA [19]含量的变化呈极显著的负相关。 2.3 衰老叶片中光合速率的变化 [20] [21]光合能力下降是衰老叶片的一大特征。陆定志等对杂交水稻抽穗结实期间叶片生理生化研究结果表明，叶片衰老时，最早出现光合作用速率下降。大豆品种8912、8716和鲁豆4号的倒1叶和倒3叶的光合速率在初起时达到高峰， [22]而后下降。一方面可能是因为植物衰老后，根系吸水能力减弱，体内相对含水量减少，水势下降，导致气孔关闭，阻碍CO进入叶内而使光合作用降低。2 另一方面，衰老引起的非气孔因素亦是降低光合作用的重要原因。在棉花、小麦和向日葵等作物中发现水份胁迫等逆境引起气孔关闭后胞间CO浓度出现升高2 [23]现象，表明光合下降并不完全是由于CO供应不足所致。Giles指出衰老叶片2 光合作用的下降，与抽穗开花后叶绿体结构的紊乱有着内在的联系。叶绿体结构的破坏是造成光合作用下降的重要原因。正常生长的小麦叶片，叶绿体呈纺锤形，在叶肉细胞内沿质膜边缘排列，基粒片层整齐并通过间质片层互相连接，类囊体腔小而扁平，细胞和叶绿体的双层被膜清晰可见。 [24]当叶片处于干旱逆境或衰老时，膜的相对透性增大，用小麦做实验得知，-1.0MPa处理24h膜透性比对照增加了63.9%。作为膜受伤害的另一个指标，脂质过氧化产物MDA含量也增多。经-0.25MPa和-1.0MPa处理24h后分别从对照 -1-1-1的267.9µmol?mgprotein增加到384.2µmol?mgprotein和595.6µmol?mgprotein。叶绿体在叶肉细胞中的排列呈现紊乱，基粒间连接松弛，类囊体内腔膨大，叶绿 [25]体双层被膜部分出现损坏，脂质小球增多。史兰波等研究指出，在生产上抗旱性弱的小麦品种山前麦叶片水分胁迫24h后，MDA含量为对照的2.7倍，此时叶绿体内基粒数目明显减少，类囊体空间增大，空泡化，类囊体排列方向发生 [26]改变，产生扭曲现象。Heath等发现，叶绿素的漂白与MDA的产生是同时发生的，MDA最大值的出现和叶绿素的完全漂白在时间上是一致的。叶绿体的脂 [27]质过氧化可能与光系统II的失活有关。低温引起黄瓜幼苗子叶MDA含量上升时，子叶的光合速率和叶绿素荧光下降，表明光系统II已受到损伤。另外许多研究表明低温下黄瓜幼苗子叶膜过氧化产物MDA随低温持续时间的延长和胁迫程度的加强而增加，光合速率和叶绿素荧光则随之下降。无论延长胁迫时间或增加胁迫强度，膜质过氧化产物MDA含量与光合作用均呈一定的负相关，表明随着叶片衰老的发生膜脂过氧化对植物的光合作用有抑制作用。用MDA处理苋菜离体叶片的试验显示，MDA抑制离体叶片的光合速率，降低磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，加速叶绿素降解，促进暗呼吸速率，表现出对光合作用的明显伤害。 膜脂过氧化引起叶绿体超微结构的损伤和叶绿素降解，是植物光合能力下降的主要原因。 2.4 衰老叶片中其他物质的变化 在叶片衰老过程中，还有一些其他物质像脂类、核酸等物质也各自发生着变化。衰老期间，细胞膜的结构和功能完整性都趋于衰退，导致了膜脂代谢的加速。细胞核及核内物质如DNA、RNA、组蛋白及非组蛋白等会产生较大的变化，染色质凝缩和核DNA的损伤也是叶片衰老的基本特征之一。 3 影响高等植物叶片衰老的因素 高等植物叶片的衰老，是受环境因素和内在因素共同调节的过程。环境因素 2+主要包括温度、水分、营养、光照等。内因包括激素、多胺、Ca、活性氧及受基因的调控。 3.1 环境因素 极度温度、干旱、臭氧、营养缺乏、病原体感染、伤害和遮阴等都是引起植物叶片衰老的因素。有限的水和营养供应是引起植物叶片衰老的主要因素。植物进化过程中发展出一套对抗逆境的机制，某些器官或组织的衰老被引发，营养物质更多地分流到生殖器官，以减少生活力低的器官的水消耗和保证植物在逆境下完成一个生活周期。 叶片衰老是植物发展过程中必不可少的部分，光敏色素信号途径和光合作用水平与叶片衰老的引发机制有关。植株上部叶片和株冠下避阴处叶片比较，前者优先吸收红光，所以避阴处叶片获得较低的红光/远红光比率。减少PAR(Preferential absorbance of red photons,红光优先吸收率)和降低红光/远红光比 [28]率是引发避阴处叶片衰老的信号。事实证明，转基因烟草过量表达光敏色素A [29](phyA)可以延缓避阴处叶片的衰老。这是由于phyA过量表达可以增加避阴处叶片对强光的或者对红光/远红光的感受性。黑暗是一种极度的避阴现象，研究认为暗诱导叶片衰老与程序性衰老是同步发生的。当光合作用低于叶片不再向植株其他部分供应固定碳的接近或补偿点，即临界值时，叶片开始衰老。 3.2 内在因子 在环境因素适宜的情况下，叶片内激素、自由基和基因对引发衰老起主要作用。 3.2.1 植物激素在叶片衰老中的调节 植物叶片的衰老严格受体内激素的调节，参与调节的激素有细胞分裂素(CIK)、乙烯(ETH)、脱落酸(ABA)、和生长素(IAA)。 CIK是一类较活跃的植物激素，它不仅能促进植物细胞的分裂和扩大，而且在芽分化的诱导、叶绿体的发育、养分的运输和分配、细胞衰老的抑制等方面都 [30]表现显著的效果。其调节植物衰老的作用最早由Richmond和Long于1957年观察激素能阻止欧龙牙草离体叶片的蛋白质和叶绿体的损失而得到证实。在植物衰老过程中，细胞分裂素能调节叶绿素的合成，物质的分解代谢，矿质营养的转移和再分配等多种生理生化过程，在分子水平上对衰老相关基因的表达起到了激活，表达增强和表达抑制等调节作用。 ETH可促进衰老，是典型的促衰激素。ETH可以加快衰老相关基因(SAG) [31]的表达，抑制光合基因的表达。研究发现，ETH处理后的幼叶，SAG的表达没有升高，而作为对照ETH处理的老叶，SAG的表达增强，并伴随衰老现象的发生。ETH虽然能促进衰老，但并不是衰老的必需因子。 ABA促进衰老，诱导气孔关闭，是仅次于ETH的第二个促衰剂。ABA对衰老的作用也发生在基因转录水平上，表现为直接控制mRNA合成，ABA也可 [32]影响mRNA的稳定性，在水平上控制基因表达。但是，Wollaston等认为，ABA不是衰老的关键因子，可能是一种抵御胁迫和衰老的激素。 IAA促进核酸和蛋白质的生物合成，增加细胞质的新成分，延缓衰老。包方[33]等采用cDNA阵列技术检测拟南芥悬浮细胞系，经IAA处理前后基因表达的变化，初步鉴定了一个受外源生长素抑制的叶绿体蛋白酶调节亚基cIPC基因的功能，证明该基因在衰老叶片被诱导，是一个衰老相关基因。但在许多情况下，IAA不是抑制衰老的重要因子，这是因为在植物的生长后期，IAA可以促进ACC合成酶的合成，可间接提高ETH的合成，促进衰老。 3.2.2自由基与高等植物叶片的衰老 2--植物体内的自由基是指植物代谢过程中产生的O、OH等活性氧基团或分子，当它们在植物体内引发的氧化性损伤积累到一定程度，植物就出现衰老，甚至死亡。但植物在长期进化过程中在体内形成了一套抗氧化保护系统，通过减少自由基的积累与清除过多的自由基两种机制来保护细胞免受伤害。生物体内的抗氧化剂主要有两大类，一是抗氧化酶类，主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧 化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POX)等;二是非酶类抗氧化剂，主要有维生素E、维生素C、谷胱甘肽(GSH)等。许多研究表明，在缺氧条件下，生物体内SOD、CAT活性下降。对菜豆子叶超氧化物歧化酶活性研究发现，其SOD活性 [34]随组织衰老而下降，表明植物组织酶的清除能力随年龄增加而下降。 已有的证据显示，自由基、活性氧对植物的损害作用主要表现在生物膜损伤、呼吸链损伤、线粒体DNA损伤等。大多数研究集中在活性氧所引发的膜脂过氧 2--化方面。膜脂过氧化即自由基(O、OH等)对类脂中不饱和脂肪酸引起的一系列自由基反应。脂氧合酶是一种氧合酶，专门催化具有顺-1,4戊二烯结构的不饱和脂肪酸的加氧反应，其中间产物自由基和最终产物丙二醛都会严重地损伤生物膜。丙二醛具有强交联性质，能与蛋白质、核酸游离的氨基结合，形成具有荧光的Schif碱，称为类脂褐色素，是不溶性化合物，干扰细胞内正常生命活动代谢。 [35]同时，丙二醛与生物膜中结构蛋白和酶的交联，破坏它们的结构和催化功能。 活性氧、自由基还能直接与核酸分子作用，使碱基羟基化，发生突变，从而改变核酸的结构。用自旋捕集技术和ESR法，通过研究紫外线辐射核黄素产生 2-的超氧阴离子自由基(O)等活性氧与嘧啶碱基及核苷的反应，发现该反应不是直接进行，而是通过羟自由基来实现的。 线粒体呼吸链是细胞内自由基的主要发生器之一，它本身易被自由基损伤。 2-在衰老的植物组织中电子传递链的失衡使得部分电子泄露给O，呼吸链电子传 2-递出现短路，其结果使ATP生成减少，O等活性氧的产生增加，从而影响细胞 [36]的功能。 3.2.3细胞的程序性死亡与高等植物叶片的衰老 植物在长期进化和适应环境的基础上有选择性地使某些细胞、组织和器官有序死亡，称之为程序性死亡(programmed cell death，PCD)。植物PCD是指整个原生质(有细胞壁或无细胞壁)在植物某个生命时期主动撤退、消化过程，它在去除不需要细胞质或整个细胞时主要通过以下机制:自溶、裂解和木质化。 完整的植物衰老过程应包括两个阶段。第一阶段为可逆衰老阶段，细胞以活体状态存在;第二个阶段为不可逆衰老阶段，细胞器裂解，细胞衰退，PCD发生，其中液泡的裂解和染色质降解形成的DNA片段是PCD开始发生的标志。胞间基质相互作用，为细胞的分化、生长和死亡提供必需的信号，MMP为基质金属 蛋白酶可降解基质。Delorme等在黄瓜叶片衰老的后期检测到一种基质金属蛋白酶CS1-MMP,它是一种前体酶，须经过修饰才能活化，其表达早于DNA片段化的出现，但不参与衰老中营养物质的运转，可能与PCD的发生有关。由此认为:PCD可能只在衰老的末期发生，即植物衰老时能达到一个不可逆的点，这个点的出现标志着PCD的发生。Rao和Davis(2001)发现:缺少邻羟基苯甲酸(SA)信号传导途径的拟南芥突变体pad4，其叶片长时间保持黄化状态，而不发生坏死，细胞死亡速度比野生型慢的多。野生型拟南芥SA信号传导途径中被诱导表达的一个衰老特异基因SAG12只在衰老晚期的黄化组织中表达，由此认为:植物衰老前期产生的SA信号可诱导下一步的PCD，SAG12可能在衰老后期的PCD过程中起关键作用。所以，更确切地说，PCD是衰老的一部分。植物内部发育信号和外部环境信号促使衰老发生，衰老中产生的一些信号物质又诱导了PCD的发生，而当PCD启动后，内外环境的信号分子也可影响PCD的进程，PCD的 [37]发生使得植物衰老进程完整化，从而在器官或整体上完成生命的历程。 4 存在的问题及展望 近年来，植物衰老研究日益得到重视。衰老是如何启动的;衰老过程中发生了哪些事件;衰老的结果是否必然导致死亡;局部衰老对整体有何影响,许多问题亟待解决。衰老的原因可能由多种因素引起，所以存在多种有关衰老的理论，这些理论彼此并不完全孤立。目前对植物衰老机制的认识还很肤浅，在许多方面需进一步深入研究，应用分子生物学和细胞生物学等当代最新技术，在分子水平、亚细胞水平上深入揭示不同器官、组织及不同细胞衰老机制及其与衰老关系，尤其是揭示衰老的启动、发生、发展的规律，才能彻底了解植物衰老的机制。 参考文献 [1]杨淑慎，高俊凤，李学俊(高等植物叶片的衰老[J](西北植物学报(2001，21(6):1271-1277 [2]Huffaker EC，Pererson LW(Protein turnover in plants and possible means of its regulation[J](Ann Rev Plant Physiol 2001，25:363 [3]Wittenbach VA(Induced senescence of intact wheat seedings and its reversibity[J](Plant Physiol 2001，59:1039 [4]戴金平，沈征言，简令成(低温锻炼对黄瓜幼苗几种酶活性的影响[J](植物学报，2001，(8):627-632 [5]吴光南，刘宝仁，张金渝(水稻叶片蛋白水解酶的某些理化特性及其与衰老的关系[J](江苏农业学报，2005，1(1):1-8 [6]宋松泉，苏卫珍，袁晓南(杂交水稻离体叶片衰老与蛋白代谢的关系[N](中山大学学报论丛，2005，1:20-23 [7]Ray S，Choudhuro MA. 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