白纹伊蚊细胞色素P450

白纹伊蚊细胞色素P450 码26KDaGST崎基园序列)中.在太肠杆菌BL21(DES)中进行原棱表达.将细菌总蛋白进行SDS幕西烯晚胺鞭肢电泳舟新, 通过Weatmmblot舟折鉴定日的蛋白的位置.并运用控酸蛋白分析倪扫描凝肢以确定表迭产物的含量.结果获得了高效表 达的融台蛋白GST—CYP6N3.表达量占菌体总蛋白的37.49%.结论本实验成功地异辣表达了自纹伊蚊CYP6N3基目.为 体,卜重建细胞色素P~50CYP6N3单加氧癣系,了解CYP6N3基园结构功能羌秉奠定基础. 关键词:白纹伊蚊;gi0n tllT-vectc~andid?曲edby3equ曲dI1g.Then.CYP6N3wsss,~do.edintotheor_甄pre璐|衄vectorpGEX-4T-1(withGST- ??digcodeas).Therecombinantvectors础e~tpressedinE.colistrainBL21.TproteinsofE.coli钾骶刖1ab勰dbySDS- PAGEandWester1]blotandscannedbynucleicaeid-proteinanaly~insnume ?t.R~altsThefusionproteinGST-CYP6N3msob. tain~.wh0scxpf皤?levdwasllj曲upto3749%intotalproteinsofE.coti.Conclusion1附】曲tstudy,CY~N3gene 蛐删叩曼囊 IfLmyinE.co/iandthefusionproteinGST-CYP6N3obtained.wI1ich妇aba凼of~tutingeytochnnne P450CYP6N3m????andfurtherleamlngstructttre-{unefionrelationship sofCYP6N3gene. KEYW0RDs:Aa正atbop/cta~;Coch删eP450;CYP6N3|He~exolvgousexpre~,on 中围分类号}R384.1文献标iR码:A 城市蚊种白纹伊蚊是我国登革热的重要传播媒 介,随着城市化的发展而对人类的危害El益严重. 化学杀虫荆的广瑟应用使得蚊虫对杀虫剂产生抗 性,抗性产生的重要机理之一就是细胞色素P450 单加氧酶系介导的代谢抗性.为此,对细胞色素 F450的深入研究将为蚊虫的抗性防治提供必要的 信息. CYP6N3基因是本室周国理等1从自纹伊蚊中 首次分离鉴定的细胞色素P450全长cDNA.它同时 存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中.为了 解CYP6N3基因的结构功能及其与抗性的关系,本 实睑对CYP6N3基因进行原核表达,为进一步的酶 蛋白功能研究奠定基础. 1材料与方法 11材料 1.1.1实验虫株白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株:由广 东药学院寄生虫学教研室惠赠,并经本室连续选育 4年.抗性倍数达50倍以上. 1.1.2主要试剂组织中总RNA抽提试剂盒, DNA凝胶回收试剂盒均为Qiagen公司产品; RNaseH一反转录酶(MMLV)为GIBc0L公司产 *广东自卉=}科学基盎赉蔚疆目(970092);”211”重点学科建设 基盘项目(98124) 作者单位中山压科大学丰生虫学教研室(广州.510080) 10中国人兽共患病杂志ChineseJouz’nalof2cl?es2002.18(2) 品;载体pGEM~一TEasyVector为Pmmega公司 产品;宿主菌JM109.BL21(D】1j)为本室保种;融合 表达载体pGEX一4T一1,山羊抗GST多克隆抗体 均为Pharmacla公司产品;兔抗山羊IgG(过氧化物 酶标记)为武汉博士禧生物工程有限公司产品. 1.2方法. 1.2.I特异引物的设计根据本课题组获得的白 纹伊蚊cY1)6N3基因全长cDNA序列,分别选择其 起始密码子及终止密码子旁侧序列.设计1对特异 性引物.引入BamHI—SalI双酶切位点: H:5 P2:5, <3, <3, 引物由上海生工公司合成.使用前用ddI-I20稀 释至10v.M. 1.2.2成蚊总RNA的提取采用(~agenTotal RNA抽提试剂盒. 1.2.3蚊总RNA为模板的RT—PCR参见 RNaseH一反转录酶(MMLV)使用. 1.2.4RT—PCR产物的TA克隆与测序鉴定参 照文献E23,RT—PCR产物经凝胶回收试剂盒回收 纯化后.与pGEM”一T载体在T4DNA连接酶催化 下4?连接过夜.连接产物转化大肠杆菌JM109;挑 取单个白色菌落以碱裂解法快速小量抽提质粒 DNA.经电泳初筛,酶切鉴定,PCR鉴定后.送交大 连宝生物工程公司进行测序. I.2.5克隆基因的序列分析用Pc/GENE序列 分析软件将所得DNA序列翻译成蛋白质序列,并 与巳知的CYP6N3序列进行比较. I.2.6重组表达质粒pGEX一4T—I/CYP6N3的 构建分别用BamHI,SalI双酶切含c6N3基 因的T—A克隆和表达载体pGEX一4T一1,将 CYP6N3基圆和缄状质粒回收纯化后进行连接.连 接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后 于含氨苄青霉素的培养基经37”C培养12,16h.随 机挑选多个菌落进行电泳,酶切,PCR鉴定.获得重 组表达质粒pGEX一4T一1/CYP6N3. 1.2.7重组表达质粒的原棱表达先在37?, 250r/min的条件下使过夜宿主菌BL21(DE3)大量 生长至对效生长期(OD600约为0.5).然后加入 IPTG至终浓度为lmM.在28?,220rpm/m条件下 进行诱导,观察表达蛋白量的变化.经过8h的诱 导,对菌体总蛋白行?PAGE及核酸蛋白分析仪 扫描分析. I.2.8表达蛋白的Westernblot鉴定通过电转 移将SDS聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白条带转移到硝 酸纤维膜上,用封闭液封闭非特异性结合位点后.先 后与山羊的抗GST多抗(1:500稀释),过氧化物酶 标记的兔抗山羊IgG(1:200稀释)结合.再用酶底 物二氨基联苯胺一过氧化氢进行显色. 2结果 2.I克隆基因的序列测定及同源性比较测序结 CY1unlnduced:Lane3:pGEX一4T一1.md; Lane4:pGEX一4T一1unlnduced m啪啪m:詈 竹 2002,18(2)中国人兽共患病杂志 ChineseJournalofZoonose$11 田3鲫一CYP6N3甚合蛋白的Wtnaetnblot鉴定 ?3Wutenab】mamtllm~ofthefusioa0~ote~跚一 CYP6N3 M:pt~einmolecularwei曲tmaLrker~;I.dlne1:thep】ofE.cogBIll 因的大小完全相同,含有完整的编码区序列.经 PC/GENRE软件分析,该基因与CYP6N3vl—v3分 别有3,1,3个氪基酸的差异(图1),同源性分别达 到99.40%,99.80%,99.4O%.因此应为CYP6N3 基因或其变异体. 2.2CYP6N3基因的原核表达及鉴定SDS/ PAGE结果显示:与含空表达质粒菌相比.在蛋白分 子量标准66.2,97.4kDa之间,含重组表达质粒菌 有一条明显的新增蛋白条带,大小与所预测的融合 蛋白分子量81.5KDa相符,且能特异地被抗GST 多抗识别,说明其确为GST—CYP6N3融合蛋白 (图2,3).经核酸蛋白分析仪扫描分析:融合蛋白 量占细菌总蛋白的37.49%左右(图4). 3讨论 本实验采用的表达载体是融合表达载体pGEX 一 4T一1.该载体中SD序列下游就是谷胱甘肽琉基 转移酶(GsT)基因,而克隆的外源基因则与GST基 因相连.当进行基因表达时,表达产物为GsT和目 的基因产物的融合体.这个载体系统具有如下优 点:?可诱导高效表达;?载体内含有laeI阻遏蛋 白基因,因而外源基因表达受Iac阻遢蛋白的负调 节,并被IPTG所诱导;@应用亲和层析介质Glu- tathioneSepharose4B,表达的融合蛋白纯化方便;? 使用凝血酶(throrabin)和Xa因子就可从表达的融 合蛋白中切下所需要的蛋白和多肽【3】. CYP6N3基因编码区长度为1491bp.表达产物 的理论分子量为55.5KDa;GST的分子量约为 26kDa,因此,PGEX/CYP6N3重组表达质粒表达的 融合蛋白GSTcYP6N3分子量约为81.5KDa.由 图2可见,与含空表达质粒菌相比,在蛋白分子量标 准66.2—97.4KDa之间.含重组表达质粒菌有一条 明显的新增蛋白条带.太小与所预测的融合蛋白分 子量相符,Westernblot鉴定为所需的目的蛋白,凝 胶扫描分析表达量占菌体总蛋白的37.49%,说明 CYP6N3基因获得了高效表达. 对昆虫细胞色素P450基因进行异源表达是研 究其结构功能关系及其表达调控的重要途径.An- dersen等Ca3,Guzov等【”,Sutherland等【在大肠杆 菌中分别表达了家蝇CYP6A1,家蝇线粒体 CYP12A1和蟑螂CYP4C7;Ssgler等【7J及Smith 等?在酵母中分别表达了果蝇CYP6A2和家蝇 CYP6D1;DLlllkOV等【9],Ma等C10J及Hung等【1l在 昆虫细胞中分别表达了果蝇CYP6A2,黑凤蝶 CYP6B1和虎风蝶CYP6134.这些学者都成功地在 体外重建了细胞色素P450单加氧酶系,明确了所研 究P450的底物特异性及其表达的可诱导性,从而确 证了CYP6A1,CYP6D1与昆虫抗药性密切相关, CYP12A1也参与各种杀虫剂和外源化合物的代谢. 本实验成功地获得了融合蛋白GST— e6N3,这只是对c6N3基因结构功能关系研 究的第一步.我们可以通过亲和层析桂纯化融合蛋 白,切除GsT后,在P450氧化还原配体存在的条件 下,重建体外单加氧酶系统,了解CYP6N3的酶活 性及底物特异性,是否代谢漠氰菊酯而与蚊虫对该 杀虫剂的抗性有关,从而明确CYP6N3基因的结构 功能关系. 枷 中国人,北京:中国 协和医科大学出版.2O0O:373—375. Az~enenJF,Utennoh3~JG-吼dFeyetebenRE坤resai0ndhome 丑yCY州endNADPH一?cb埘P4513rectuct~einE cb虹h诅ca”endr0nd0nofan髀cdcid亡—abd衄P450 ,t血【J].Bi?m.哪,1994.33(8):2171—7 Gu自vM.U毗d山呲GO,a搬TI.日0l从..CYPlZALamJto一 岫越州蚵咄P车5o[ro脂腺脂类微 小环境中,取皮肤皮脂分泌物检查是常用的诊断方 法,在检查中存在着标本难以长时间保存的问题,笔 者采用了简易的方法可使保存蠕形螨虫体各期形态 标本的时间延长2年以上,并染色观察有关形态,方 法操作简便实用,以提供教学研究之需要.现将方 法与结果介绍如下. 1方法 1.1溶脂剂+戊二醛取皮脂后刮入含10%洗洁 精(市售上海白猫牌)和5%戊二醛的试管中,反复 冲洗吹打后,静置5mln,离心弃上滑,重复3次.沉 渣中各期虫体可从皮脂中洗脱分离并固定,备用. 1.2二甲苯+缓冲液将皮脂放入二甲苯和 pH7.4礴酸缓冲液(PBs)的分离液项的试管中,反 复冲洗吹打后,静置5min,离心后,分别吸出上分离 液,取沉渣移入3%,5%戊二醛液固定10--15r~n, PBS洗涤离心.取沉渣备用. 1.3制片与染色 1.3.1取上述洗脱分离的沉渣用甘油明胶封片,光 镜下观察或相差显微镜下观察. 1.3.2按常规脂肪类染色方法,取上洗脱沉渣于试 管中.分男4用1%酸性品红,油红O或苏丹?进行染 色,经分色冲洗后用甘油明胶封片,光镜下观察. 2结果 用溶脂溶剂一戊二醛液这种亲水性液可从皮脂 类物质中将虫体洗脱出并同时可固定虫体的形态. 用油溶性和水溶性形成油水分层液相,皮脂类物在 水溶性液中上浮接触脂类溶剂二甲苯,脂类物质披 溶解.虫体游离.经离心后虫体进入缓冲液中,再进 行固定.经过处理蠕形螨各期虫体易与皮脂,角质 蛋白等成分溶解分离.镜下可见各期虫体形态完好, 无皱缩现象.可清晰观察口孔,螯肢,须肢,背板指印 花纹,足体及足末跗节爪,末体环形纹.有时还可见 马蹄形咽泵,阳茎和体壁生殖裂隙等特殊结构.未 固定前还可进行活体运动观察. 采用脂肪类染色方法及复染,蠕形螨虫体体表 着色浅红色,可显示虫体外形,足体及分节,背板花 纹和末体环形纹尤为清楚.虫体内肠腔细胞染成浅 橘红色涡状颗粒状,其后有不均匀排列大小不等的 鲜红色类脂物的脂肪小滴(I,?类细胞),易于分 辨,颜色对比显着.虫卵卵壳清晰.卵内也有少量脂 类物质着色. 本方法制作的蠕形螨标本.分别较直接油浸片 观察各期虫体形态,背景干净,在普通光镜及相差显 微镜下又可观察虫体的细微结构及特殊结构,还能 观察蠕形螭活体运动的情况,既能满足直观形象化 教学和研究虫体运动状态,侵袭力等的特殊需要,染 色后可清楚显示蠕形螭虫体体壁嵴纹.特征性的环 形纹.体内类脂物质的形成,分布及随虫体衰老后增 多,脂肪小滴由小变大的特征性形态;并且可以较长 时间保存标本,其方法易于操作实用,若在染色上加 用复染液使多种细胞结构染色就会更好. 作者单位;石河子大学匿学院帐生曲学与竟疫学教研宣(石河子.目