年产3吨中性淀粉酶的发酵工艺设计

前言  淀粉酶属于水解酶类，是水解淀粉和糖原的酶类总称。通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。此类酶广泛存在于动、植物和微生物中，几乎所有动物、植物和微生物都含有淀粉酶。            淀粉酶是研究较多、生产最早、产量最大和应用最广泛的—类酶。特别是20世纪60年代以来由于淀粉酶在淀粉糖工业生产和食品工业中的大规模应用，它的需要量与日俱增，到目前为止，其产量几乎占到整个酶制剂的50％以上，销售金额占到55％～60％。按照水解淀粉的方式不向，主要的淀粉酶有α—淀粉酶、β—淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、环糊精葡萄糖基转移酶等。 淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之一，并且大量的微生物可以用以高效生产淀粉酶，但是酶的大规模商业化生产仍然局限于几种特定的真菌和细菌中。对于高效的淀粉酶的需求越来越多，这可以通过对现有酶的化学改良或者通白质工艺改良得到。得益于现代生物技术的发展，淀粉酶在制药方面的重要性日益凸显。当然，食品和淀粉工业仍然是主要市场，淀粉酶在这些领域的需求仍然是最大的。 中性淀粉酶是目前使用最广泛的一种酶，主要运用于发酵、食品、医药、纺织及造纸工业。就我国而言一般采用液态深层发酵法生产，但发酵水平低，过滤困难，使其发展受到了较大的限制。 本课题中以枯草杆菌为实验菌株，采用液体摇瓶发酵，并在培养基中添加发酵助剂来提高酶活。 枯草芽孢杆菌可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，可在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用。枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。 1. 菌种的选育 1.1 菌种的选育及制备 微生物是各种生物活性产物的丰富资源。在发酵前期，微生物的选择至关重要，我们此次设计的是利用枯草芽孢杆菌发酵生产中性蛋白酶的整体过程。 选择性分离的步骤一般是： 含微生物采集——标本材料的预处理——菌种的分离——富集培养——菌种初选——菌种复选——性能鉴定——菌种保藏。 1.1.1 含微生物材料的选择 土壤是微生物聚集最丰富的场所，菜园和农田耕作层土壤含有丰富的有机物常以细菌和放线菌居多，由于枯草芽孢杆菌生活在中性的环境中，可以采集中性的土壤。 采土时先用小铲除去表土，取5～15㎝深处的土样，选好3～5点，每点取土10g混在一起装入灭过菌的牛皮纸袋，并记录时间、地点、植被等情况。 1.1.2 预处理 在培养过程中以淀粉作为唯一或主要碳源，控制pH在 6.7～7.2。那些在所采用的条件下最适用于淀粉代谢的微生物最终将占优势，并可在淀粉琼脂糖平板上分离到产生中性淀粉酶的菌株。 1.1.3 所需菌种的纯化和分离 可用平板划线法进行菌种分离。如下：用接种管蘸取少量经增殖培养后的菌液，在含无菌固体培养基的平板表面上进行规则划线，操作时由右向左轻轻划线，划线时平板面与接种环成30°～40°，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，线条要平行密集，使两线不能重叠，充分利用表面积，划线时接种环不要嵌入板内划破培养基，密集的含菌样品，经过多划线稀释，使菌体在平板培养基上逐渐分离成单个菌株，经培养繁殖成单个菌落，反复进行几次平板划线分离，可得枯草芽孢杆菌野生菌株。 1.1.4 菌株的培养 常用培养基配方：1L蒸馏水，10g蛋白胨，3g牛肉膏15～20g，琼脂5gNaCl。本课题以麸皮、豆饼粉作为天然培养基，在37℃保温箱中培养，至培养基中部分出现成熟颜色即可进行保藏。 1.1.5 菌落的选择 初筛采用透明圈法，方法为在培养基里接入淀粉天青，接入含菌样品后，可在菌落周围清晰地观察到淡蓝色晕环，初筛选出的微生物经过菌株性状试验后已确定具有一定生产能力的菌株还要进行复筛。 方法：将初筛后的少数菌株接种于40 ml 锥形瓶内的液体培养基中，110次/min 往复式摇床式震荡培养，得到摇瓶种子。 1.2 诱变育种 诱变育种可以利用物理、化学因素诱导遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求如高产的个体，进而培育成新的品种或种质。 诱变育种操作程序如下： 出发菌株→纯化→培养液→细胞或孢子悬液→诱变剂处理→中间培养→平板分离→初筛→复筛→生产性能实验→菌种保藏。 1.2.1 出发菌株的选择 由于野生型菌株生产性能较差，通常采用经历过生产条件考验的菌株，即经过液体培养的摇瓶种子，这类菌株一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。 1.2.2 菌悬液的制备 细菌一般要求处于对数生长中期的菌，用玻璃珠振荡5 min，使细胞均一分散，然后用灭菌脱脂棉过滤，得到分散菌株。菌悬液的细胞浓度不宜过高，本课题中的枯草芽胞杆菌，宜将其浓度控制在108个/ml。菌悬液介质一般用生理盐水。 1.2.3 诱变剂的处理 诱变剂包括物理、化学、生物诱变，在微生物诱变育种中，可用物理化学复合诱变因素处理菌种，这样可以扩大培养幅度，提高诱变效果获得中性淀粉酶高产突变株。方法及步骤如下： 吸取制备好的枯草芽孢杆菌悬液5 ml于直径为6㎝的无菌培养皿中，然后用0.5%～1%的二乙酯处理30 min，处理时采用pH 7.0的磷酸缓冲液，再将磁力搅拌器于紫外灯下（距离30 cm）1 min，接着在红灯下吸取经处理的菌液0.5 ml，稀释至10-6，取10-6～10-1稀释液滴一滴于6个平板中，10-6～10-1 依次涂布均匀，再置暗箱内与37℃培养48 h。 注意：一般化学诱变剂均有毒性，多数还具有致癌作用，故操作时切忌用口吸取并勿与皮肤直接接触，做好安全工作。 1.2.4 突变菌株的筛选 包括：琼脂块透明圈法初筛。 方法：倒入选择培养基6皿，取其中较厚的2皿，用打孔器或玻璃打制圆形培养基→平移琼脂块至一个选择平板上，再用接种针挑取单菌落的少量菌体分别接种于琼脂块中心并与一琼脂块接入出发菌株作为对照→正置于37℃培养45小时→于培养好的选择平板中滴加几滴淀粉天青，观察到透明圈的直径→选择透明圈大的菌落接入斜面备复筛用。 摇瓶发酵复筛：将经初筛处的菌株分别接入增殖培养基中，培养13小时→分别接种于锥形瓶发酵培养基中→置37℃摇床上发酵40小时→选出酶活力较高者进一步复筛直至选出中性淀粉酶高产突变株。 1.3 菌种的保藏 菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。常用的菌种宝藏方法有：斜面冰箱宝藏法、沙土管宝藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。 在这里我们采用沙土保藏法。 2. 培养基的配制 2.1 培养基的类型 培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。 2.1.1菌种的活化 将保存的菌种转接到斜面培养基，37度培养24h备用。 2.1.2 种子培养基 种子培养基是供发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。 枯草芽孢杆菌的种子培养基的配置：将豆饼1%、蛋白胨1%、酵母浸出物0.5%、氯化钠1%配置成种子培养基(pH 7.1～7.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。 2.1.3发酵培养基 发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。 枯草芽孢杆菌的发酵培养基配方是：玉米粉10％、豆粕水解液6％～7％、Na2HPO4·12H2O 0.8％、(NH4)2SO4 0.4％、CaCl2 0.2％、NH4Cl0.15％、豆油1kg，调pH至 6.5～7.0。 2.2 培养基的营养要求 培养基的成分大致分为碳源、氮源、无机盐、微量元素、特殊生长因子、促进剂、前体和水等几大类。对不同的微生物，微生物不同的生长阶段，不同的发酵产物以及不同发酵工艺条件等，所使用的培养基都是不同的，这些也都是培养基配制需要考虑的因素。 2.2.1 水  水是所有培养基的主要成分，也是微生物机体的重要组成成分。水是良好的溶剂，又是活细胞中一切代谢反应的媒介物，还可以维持细胞中的渗透压，同时水又是热的良好导体，有利于散热，可调节细胞温度。在中性淀粉酶的发酵生产中，为了避免水质变化给生产带来不良影响，发酵用水采用深井水，并定期检查水质，要求：pH 6.8～7.2，电导率500～1500μΩ/cm，总硬度 100～230 mmol/L。 2.2.2 碳源 碳源的主要为微生物细胞的生长繁殖提供能源。目前生产中性淀粉酶的菌种为异养型微生物，所以只能利用有机碳；大量的农副产品是主要的有机碳源，如玉米粉、山芋、麸皮、玉米、米糠、马铃薯、木薯、土茯苓等淀粉质原料，这里用到的碳源是玉米粉。 2.2.3 氮源 氮源是组成蛋白质和核酸的主要元素，酶自身即为蛋白质。因此，氮源是必不可少的重要原料。常用的有机氮源油花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。我们用到的氮源是豆饼粉剂和蛋白胨。 常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。 2.2.4 无机盐类及微量元素 酶在生长和繁殖生长过程中，需要某些无机盐及微量元素如磷、镁、硫、钾、钠、钙、铁、锰、锌等。钠离子具有控制细胞和培养基之间的渗透压的作用，从而促进产酶，添加适量亚硝酸钠可提高酶活力；钙对淀粉酶有稳定和活化作用。中性淀粉酶生产中通常以氯化钙提供钙离子。 2.2.5 生长因子和产酶促进剂 酶的生产中所需的生长因子大多由天然原料提供。玉米浆、麦芽汁、豆芽汁等，都含有丰富的生长因子。产酶促进剂一般是该酶的底物和底物类似物，对于中性淀粉酶，可添加适量浓度的琼脂糖作为诱导剂。