资源植物金荞麦高类黄酮含量愈伤系的获得及其cDNA文库的构建

资源植物金荞麦高类黄酮含量愈伤系的获得及其cDNA文库的构建 资源植物金荞麦高类黄酮含量愈伤系的获 得及其cDNA文库的构建 农业环境科学2006.25(6):1679—1684 JournalofAgro—EnvironmentScience 资源植物金荞麦高类黄酮含量愈伤系的获得 及其eDNA文库的构建 刘光德,祝钦泷,郭余龙,李艳冬,罗莉莉,眭顺照,李名扬 (西南大学花卉研究所,西南大学园艺园林学院,重庆400716) 摘要:用野生金荞麦无菌苗的茎和叶片作外植体,茎在Ms添加2.0mg?L6一BA和0.1mg?LNAA的固体培养基上,通过12d 0%的诱导率;叶在MS添加1.0mg?L-16-BA和0.5mg?LNAA的的诱导,可获得10 固体培养基上诱导13d,可获得100%的诱导 率.茎和叶分别在各自激素组合培养基上连续继代3次后,用目视法直接从大量的稳定愈伤组织中筛选获得4种不同次生代谢能 力的细胞系:红色系(Stem1愈伤系),褐色系(Stem2愈伤系),浅黄色系(Leaf1愈伤系)和白色系(Leal2愈伤系).用分光光度法直接 筛选出高类黄酮含量的红色系,其类黄酮含量为6.3804mg?g-1,是含量最低的白色系的3.5倍.用改良的CTAB法提取金荞麦高黄 酮含量的红色系l一13d愈伤组织总RNA,用SMARTeDNALibraryConstructionKit 构建eDNA文库经测定原始文库滴度为1.5× 106pfu?mL-,扩增总文库滴度为7.0xl0pfu?mL,重组率达到98%.插入片段在0.5kb ,1kb以上的占66%.通过简并 到2kb之问 扩增的方式,从总文库中检测到了低峰度达的R2R3Myb转录调控因子P基因的特异片段.各项指标都表明,已获得较高质量的 cDNA文库.金养麦高类黄酮含量愈伤系的获得及其cDNA文库的构建.不但为野生金养麦的优异基因资源的保存和其类黄酮次 生代谢相关基因的克隆和调控研究打下了的基础,也为最终实现药用次生代谢产 物的规模化生产奠定了基础. 关键词:资源植物;金荞麦;类黄酮;愈伤系;eDNA文库 中图分类号:Q781文献标识码:A文章编号:1672—2043(2006)06—1679—06 TheAequisitionofHighFlavonoids-producingCallusLineandItseDNALibraryConstructionofFagopyrum dibotrys LIUGuang—de,ZHUQin—long,GUOYu—Long,LIYah—dong,LUOLi—li,SUIShun —zhao,LIMing—yang (InstituteofOrnamentalPlants,CollegeofHorticultureandLandscape,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China) Abstract:ExplantsofstemsandleaveswerefromsterileseedlingofFagopyrumdibotrys.WhenthestemswereculturedonMSmediumsup— plementedwith2.0mg?L6一 BAand0.1mg?L-NAA.theinductionratewas100%after12days.WhentheleaveswereculturedonMS mediumsupplementedwith1.0mg?L一6一BAand0.5mg?L— NAA.theinductionratewas100%after13days.Aftercontinuoustllriceeul— turesonrespectivemediumofstemsandleayes,thecalluscouldbedistinguishedbycolorwithnakedeyesintofourdifierentcelllinesof metaboliteaccumulations,ared(stem1callusline),abrown(stem2callusline),abrightyellow(1eaf1callusline)andawhite(1eaf2callus line).Asensitivespectrophotometricmethodwasdevelopedfordetectingtheflavonoidsinculturedcells.Theredlinecontained6.3804mg? gflavonoidswhichwas3.5timesmoretllanthewhiteline.TotalRNAof1— 13daysredlinecallusofF.dibotryswasextractedbymodified CTABmethod.andcDNAlibrarywasconstructedwithSMARTcDNALibraryConstructionKit.Thetiteroftlleprimarylibrarywas1.5xl06 pfu?mL-l.inwhich98%cloneswererecombinantandtheinsertedcDNAfragmentsrangedfrom0.5kbto2kb,66%ofthemmorethan1kb. rheamplifiedlibraryhasatiter0f7.0xl0pfu?mL 一.ThepositivesignalsofPgene.whichbelongedtoMybR2R3familyandexpressedat lowabundance.weredetectedbydegeneratePCRintheamplifiedlihrary.IIhedataindicatedthattheeDNAlibraryhadhighquality.The acquisitionofhighnavonoids— pmducingredcalluslineanditseDNAlibraryconstructionofF.dibotrysnotonlyprovidedausefultoolfor conservingexcellentgeneticresource,cloninggenesandregulatingresearchinthepathwayofflavonoidsbiosynthesis,butlaidtheground— workforfutureproducingmedicinalsecondmetabolicproductsonalargescale. Keywor&:resoureeplant;Fagopyrumdibotrys;flavonoids;calluslines;eDNAlibrary 收稿日期:2006—11-08 基金项目:重庆市自然科学基金(CSTC一2005881154);农业部(2004年,2005年)农 业野生植物保护财政资助项tfl 作者简介:刘光德(1963一),男,研究员,西南大学在读博士,研究方向为植物基I~t_L 程. 通讯作者:李名扬E-maihlimy@swau.cq.1311 1680刘光德等:资源植物金荞麦高类黄酮含量愈伤系的获得及其cDNA文库的构 建2006~12)1 野生金荞麦(Fagopyrumdibotrys)是蓼科(Polygo- e?e)荞麦属(FagopyrumMil1.)多年生草本植物,为国 家二级保护植物.是一种营养丰富并具有重要药用价 值的资源植物[1】.其块根活f生提取物(主要为类黄酮类 次生代谢产物)具有显着的抗癌,抑制肿瘤细胞侵袭 等重要作用.是多种重要的抗癌药物和癌预防药物 (如复方金荞麦颗粒,金荞麦片,和威麦宁胶囊等)的 主要成分之一.由于人工栽培的金荞麦产量和品质 的限制,,难以满足临床上日益增长的需要,造成了对 野生金荞麦资源的极大的破坏.因此,利用细胞培养 技术获得高黄酮含量的愈伤组织,为采用细胞工程的 大量培养生产有用的次生代谢产物并实现工业 化应用奠定了纂础[71.同时,以此愈伤组织为材料,利 用SMART技术罔构建cDNA文库,也为保存野生金 荞麦基因资源,分离克隆其药效相关的类黄酮合成途 径的基因,用基因工程手段开发野生金荞麦有效成分 与相关基础研究奠定基础. 1材料和方法 1.1材料 野生金荞麦种子来源于重庆市黔江区国家级野 生金荞麦原生境保护区.植物激素细胞6-BA(6一苄 氨基嘌呤),NAA(a一萘乙酸),焦炭酸二乙酯(DEPC) 均购自上海生工公司.芦丁品购于Sigma公司. 文库构建试剂盒SMARTcDNALibraryConstruction Kit(Catalog#:K1051—1)购自CLOTECH公司,包装蛋 白GigapacklIIGoldPackagingExtract(Catalog#: 200201)购自Stratagene公司.其他常规试剂及耗材 均为国产.序列测定在上海生工完成. 1.2培养基与培养条件 Ms[9】培养基,附加30g?蔗糖,pH5.8.培养条件 为25?,光照强度2400Lux,每日16h的光照. 1-3愈伤组织的诱导 1.3.1金荞麦无菌苗的获得 用自来水冲洗金荞麦种子并用清水浸泡过夜.剥 去种壳,在75%酒精消毒3Os,无菌水冲洗2次,再 用O.1%升汞消毒5min,无菌水冲洗5次,最后用无 菌滤纸吸干种子表面水分.将消毒处理的种子,接种 于无激素的1/2MS培养基上,暗培养.待种子萌发后 移入光照培养室. 1.3.2金荞麦茎与叶片愈伤组织的诱导 取无菌苗的茎与叶片作为外植体,将茎段切成 0.5cm左右长的小段,叶切成0.5cmz的小块,分别 接种于含不同浓度组合的6-BA(m?)和NAA(mg? )的MS固体培养基上,诱导愈伤组织,记录其发生 时问并统计诱导率,确定最佳激素组合.在含最佳激 素组合的MS固体培养基上进行固体继代培养,每隔 20d继代1次.. 1.4高黄酮含量愈伤组织筛选 1.4.1目视法筛选 采用目视法可初步确定愈伤组织的生长快慢,褐 化状况及颜色特征等情况.从MS添加6-BA和NAA 的最佳激素组合的固体培养基上连续继代3次的愈 伤组织中挑选出生长较快,或不易褐化,或颜色为红 色或深色(这类愈伤组织的类黄酮含量可能较高)的 愈伤组织. 1.4.2分光光度法筛选 将目视法筛选出的愈伤组织用722s可见光分光 光度计(上海校光)对其类黄酮含量进行测定,筛选出 类黄酮含量高的愈伤系. (1)标准曲线绘制 参照张宏志等[1删采用的黄酮比色法,以芦丁为标 准品进行含量换算.测得芦丁浓度与其吸光度的回归 方程为:Y=0.08279X+0.008348R=0.9997(X为光的 吸收增量.y为总黄酮浓度,单位为mg?m). (2)总黄酮测定 从培养瓶中称取5g愈伤组织(湿重,Fw),用10 mL95%乙醇25?振荡提取24h,过滤.吸取滤液0.5 mL,加重蒸水4.5mL,加0-3mL5%的NaNO摇匀,静 置6min.再加0.3mL10%的A1C13摇匀,静置6min. 再加4%的NaOH4.0mL,最后加重蒸水至10mL (pH>7).在510nm处测定OD值,根据回归方程计算 类黄酮含量. 1.5金荞麦红色愈伤系总RNA的提取 以诱导的高黄酮含量的金荞麦愈伤组织红色系 1,13d细胞,每日50mg,混合共计0.65g,加入含温 育的5mLRNA抽提buffer的研钵中迅速研磨(不加 液氮),转移至10mL离心管中,接下来的操作参照实 验室改良的CTAB法(另文报道)进行.采用提取其总 RNA.用岛津BioSpec—miniDNA/RNA/Protein分析仪 检测RNA的纯度及含量,用非变性琼脂糖凝胶电泳, 检测RNA的完整性. 1.6cDNA第一链的合成与LD—PCR(LongDistance PCR) 取2L(约1.5g)混合总RNA,参照试剂盒操 作程序做反转录合成第一链cDNA.取7LcDNA第 第25卷第6期农业环境科学1681 一 链,按试剂盒操作程序,预热Eppendorf5331PCR 仪到95?进行LD—PCR,条件为95?1min,然后经 历22个循环:95?15s,68cC6min,循环结束后至4 cC.取5LLD—PCR产物,1.1%琼脂糖凝胶电泳检 测. 1.7eDNA的纯化,回收与hTriplEx2的连接与包装 取5OLLD—PCR产物,参照试剂盒操作程序, 加入2L蛋白酶K(20g?L),于45?消化20 min.纯化回收cDNA,用lOLsnI(2Ou?L一')于 5O?酶切2h,将酶切产物过CHROMASPIN一400柱. 收集大于500bp的eDNA片段.取1IxL过柱cDNA, 加人1IxLhTriplex2载体(500ng?IxL),l6?连接过 夜.连接产物于65cc失活15min后,取2.5L连接 产物与25包装蛋白提取物混匀,于22?包装2 h,再向管中加人500IxL1~hdilutionbuffer,混匀.加 人2O氯仿并轻轻混匀,轻轻离心,上清贮存于4 ?.即为原始文库. 1.8eDNA文库的质量检测 1.8.1文库滴度测定 取1IxL原始文库包装物用1~hdilutionbuffer稀 释至100IxL,取其中的1OL用于测定原始文库滴 度.用9emLB/MgSO平板进行铺板.37?倒置培养 8,18h,统计噬菌斑数并用下面公式计算滴度:pfu? mL一=numberofplaque~dilutionfactor~10IxL?mL一? I,ofdilutedphageplated.按每个9em平板5xl0 个独立克隆扩增原始文库.单独收集每个平板的裂解 物,加人1/10体积氯仿.混匀后7500r?min一离心10 rain,取上清作为一个亚文库,每个亚文库取1mL混 匀为总文库.取l总文库按上述方法做梯度稀释, 测定总文库滴度.每个亚文库及总文库各取1mL保 存于4?备用.其余的均加人7%DMSO.保存于一7O ?. 1.8.2文库插入片段大小及重组率检测 从原始文库中随机挑选5O个单噬菌斑于100 IxL1xkdilutionbuffer中.振荡洗脱,于4?冰箱中过 夜.取3L洗脱物为模板,以文库载体hTriplEx2的 MCS位点上的Phl和Ph2为引物.做PCR检测插人 片段大小并估计文库重组率.扩增条件:在95?变性 10min裂解噬菌体后,再加人PCR反应混合物,并按 以下程序扩增:94?预变性4min:94?变性lmin, 56?退火1min,72?延伸4min,25个循环;72?延 伸10min. 1.8-3文库覆盖度的检测 P基因是MybR2R3家族转录调控因子.对植物 次生代谢具有十分重要的调控作用.其表达峰度很 低,约为l0一10",可以作为文库覆盖度检测的指 标.以扩增总文库的噬菌体作为模板.采用Touch downPCR.简并扩增P基因保守区.简并引物(Pl:5 - AARWSNTGYMGNYTNMGNTGG-3:P2:5一 CCARTAR1TrY1TrNAYNTSR1TrRTC一3)根据 Rabinowicz等(1999)t睃计.扩增条件::在95?变性 10min裂解噬菌体.加人PCR反应混合物.并按以下 程序扩增:94?变性4min:94?变性1min,65,45? 退火1min.每循环退火温度下降0.5?.72?延伸1 min,40个循环;94?变性1min,50?退火lmin, 72?延伸lmin.20个循环;72?延伸10min. 2结果和分析 2.1愈伤组织的诱导 消毒的金荞麦种子暗培养3d后.约98%的种子 萌发,光照培养2O,30d后长成5-6em高的无菌苗. 以该无菌苗的茎段和叶盘作为外植体进行愈伤组织 的诱导,结果见表l. 表1不同浓度的6-BA和NAA的组合对金荞麦茎段和叶盘 愈伤组织诱导的影响 Tab】e1Fheeffect0f6-BAandNAAO11thestemandleafcaI】us inductionofFagopyrumdibotrys 由表1可知.茎和叶的愈伤组织都容易诱导.在 添加2.0mg-L,6一BA和0.1mg?LNAA的Ms培养 基上,通过12d的诱导,茎可获得100%的诱导率.叶 盘愈伤组织在添加1.0mg?L6一BA和0.5mg-L NAA的MS固体培养基上诱导13d,可获得100%的 诱导率.其中在MS添加1.0mg?IJI'6-BA和0.1mg? L一1NAA的MS培养基上.茎和叶诱导的愈伤组织长 势均不好,须根生长严重. 2.2高黄酮含量愈伤组织的筛选 2.2.1目视法筛选 茎和叶分别在MS添加2.0mg?L6一BA和0.1 mg?LNAA的培养基和MS添加1.0mg?L'.6一BA和 O.5mg-LNAA的固体培养基上经系统诱导并连续 1682刘光德等:资源植物金荞麦高类黄酮含量愈伤系的获得及其cDNA文库的构建2006@12fl 继代3次,获得了大量的稳定愈伤组织.采用日视法 初步筛选出生长较快,不易褐化,颜色较深或稳定并 且继代稳定的4个愈伤系,结果见表2和图1.其中红 色和褐色愈伤系主要来源于茎的诱导,而浅黄色和白 色系则来源于叶的诱导. ?一圈一A:茎诱导的愈伤系1(红色);B:茎诱导的愈伤系2(褐色); C:叶诱导的愈伤系1(浅黄色);D:叶诱导的愈伤系2(白色) 圉1高黄酮含量金荞麦愈伤组织的目视法筛选 Figure1Screeningofcelllinesforhighflavonoidproductionfrom Fagopymmdibotryscalluslinesdistinguishedbycolorwithnaked eyesA:stem1callusline(red);B:stem2callusline(brown); C:leaf1callusline(brightyellow);D:leaf2callusline(white) 2.2.2分光光度法筛选 将采用目视法挑选出的4个愈伤系用分光光度 法直接检测类黄酮含量,结果见表2. 由表2可知,愈伤组织的颜色和类黄酮的含量有 一 定关系:颜色深的愈伤组织比浅色的类黄酮含量 高;所有愈伤组织都含有一定量的类黄酮,白色愈伤 组织类黄酮含量最低,其中红色系的含量是门色系的 3.5倍.金荞麦愈伤组织筛选实验结果也证明了高类 黄酮愈伤系筛选的可行性. 2-3总RNA的提取 采用实验室改良的CTAB法(另文报道)提取高 黄酮含量的红色愈伤系(Steml愈伤系)的总RNA.提 取的总RNA28SrRNA与18SrRNA两条带的比例约 为2:1.无明显的5SrRNA,说明所提取的总RNA没 有降解,完整性良好(图2,A).经分光光度计测定,提 取的总RNAOD260/OD280=1.901,表明RNA的均一 性较好,纯度较高,无蛋白质污染,完全符合建库要 求. 2.4eDNA第一链合成及LD—PCR 经LD—PCR,合成的双链cDNA产物大小丰要集 中在0.55.0kb之间,呈弥散状,在1.0,2.0kb附近 有较清晰的丰富带产生(图2,B),说明cDNA合成较 好.符合下一步操作要求. 2.5cDNA的纯化与回收 cDNA经分级后的16管收集液电泳结果表明, 过柱分离的cDNA片段主要集中于第六到第八管中, 因此收集并回收第六到第八管的cDNA(约120L), 最后沉淀浓缩溶于7去离子水中,取1L用于连 接实验. 2.6cDNA文库的质量检测 检测包装产物稀释后的原始文库滴度为1.5xlO pfu?mL,.扩增总文库滴度为7.0x10pfu?mL.从原 始文库中随机挑选50个单噬菌斑进行PCR鉴定,结 果插入片段分布在0.5kh到2kb之间,ikb以上的 占66%(图3),重组率达到98%.用MybR2R3家族的 P基因的简并引物从扩增总文库中扩增出了174bp (测序后的精确长度)的目的片段(图4),NCBIblastn 和blastnp结果表明该片段为金荞麦Myb转录调控 28S I8S AIj |Ijf{,AMIrI1NA I【)L}】 5.0", 2.0kb 10kl, 750 500 图2金荞麦红色愈伤系总RNA提取(A)与 LD—PCRcDNA(B)电泳 (A).总RNA;(B).M.1kbPlusDNAMarker;1.dscDNA Figure2TotalRNAfromF.dibotrys(A)andLD—PCRcDNA(B) on1.1%agarose 表2高黄酮含量金荞麦愈伤组织的分光光度法筛选 Table2ScreeningofcelllinesforhighflavonoidproductionfromFagopyrumdibotryscallusl inesbyspectmph0t0lnetcmethod 第25卷第6期农业环境科学1683 因子家族的一个成员,编码保守的DNA结合结构域 (图5),这表明文库具有较高的覆盖率,足以获得目 的基因.上述各项指标都表明已获得较高质量的 eDNA文库. 3讨论 3.1高黄酮含量愈伤系的筛选 稳定,高产的细胞株系的筛选与获得,是采用细 胞工程手段,规模化生产次生代谢产物的前提ll31.而 750hp 500hp 250bp 1Of)bp M,DL2000DNAMarker;1,P基因保守片断 图4文库P基因保守区的简并扩增检测 Figure4DetectionofdegeneratePCRofPgeneconserved regioninthelibrary M,DL2000DNAMarker;1,ConservedfragmentofPgene 圈5P基因片段的保守结构域 Figure5Aconservedmyb—DNA—bindingdomainofPgeneby NCBIblastp 2.0kh 1.fJk}' 750b1) 5(】{)Il1 利用培养细胞的异质性及变异性筛选出所需要的高 产细胞株系,是植物细胞培养生产有用次生代谢产物 的关键之一r7l.高产细胞株系筛选的常用流程为:选择 合适的材料,从不同来源的材料建立细胞培养物,获得 大量的细胞系,然后从中选择出次生物质产量高的细 胞株系,采用比色法,HPLC,MS等方法来加以分析『14J. 分析方法中,根据愈伤组织的颜色差异,用目视法筛 选获得高产细胞系是常采用的方法_15.本文采用金 养麦无菌苗为材料.茎在MS添加2.0mg?L-6一BA和 0.1mg?LNAA的固体培养基上,通过12d的诱导. 获得了100%的诱导率:而叶在MS添加1.0mg?L 6-BA和0.5m只?L—NAA的固体培养基上诱导13d, 获得100%的诱导率.采用目视法和比色法在连续三 代继代的愈伤组织中,选出了较稳定的红色系(Stem1 愈伤系),褐色系(Stem2愈伤系),浅黄色系(Leafl愈 伤系)和白色系(Leaf2愈伤系).其中红色系的类黄 酮含量是白色系的3.5倍.因此采用本文的研究方 法,不仅对金荞麦高黄酮含量愈伤系的筛选具有应用 前景,对其它细胞系的筛选也有参考价值,并为最终 实现药用次生代谢产物规模化生产奠定了基础. 3.2愈伤组织RNA提取 由于金荞麦本身富含多糖,多酚,经过细胞培养 后.其愈伤组织的糖类和酚类化合物剧增,并富含一 些其他次生代谢产物,严重影响到RNA提取.常规方 法,如异硫氰酸胍法,冷酚法,热酚法等和多种RNA 提取试剂盒.均无法得到较高纯度的金荞麦愈伤组织 RNA.甚至根本得不到RNA.采用本实验室改良的 CTAB法(另文报道)则可以获得纯度高,质量好的 RNA用于eDNA文库的构建.类黄酮类次生代谢产 图3eDNA文库插入片段大小及重组率检测 M.DL2000DNAMarker;CK一:阴性对照;1—21:单噬菌斑编号 Figure3Detectionofinsertsofthelibraryandthecombiningrate M.DL2000DNAMarker;CK-:Negativecontrol;1~21:Thenumberofsingleplaques 刘光德等:资源植物金荞麦高类黄酮含量愈伤系的获得及其cDNA文库的构建 2006年12B 物是金荞麦的主要药效成分,其含量的高低由类黄酮 合成途径的众多结构基因(主要为酶)和调节基因(转 录调控因子)决定?.因此,以高黄酮含量的红色系 l,13d培养的愈伤组织为材料提取总RNA,有利于 获得类黄酮合成相关基因高表达的eDNA文库. 3.3eDNA文库的构建 在类黄酮代谢途径中次生产物的积累与该途径 中的结构基因和调节基因的表达密切相关.要从分子 水平上研究金荞麦药效成分的累积,就必须首先得到 相关目的基因.克隆目的基因的方法有多种,其中通 过构建高质量的eDNA文库筛选目的基因的方法,具 有成本低,效率高,适合多基因克隆的特点.而要获得 高质量的eDNA文库,就必须保证文库的完整性和覆 盖度.由于建库的方法不同,所获得的文库在完整性 和覆盖度上就存在差异. 传统的构建方法,是用Oligo(dT)或随机引物作 为引物逆转录合成eDNA,通过酶切削平末端,并连 接到适当的载体.这种方法虽然实用,费用低,但其难 以获得低丰度表达基因,且mRNA消耗量大,5端还 常不完整Il9L91而一些改进的方法.是在RNA水平上添 加5端接头,再用接头3端的通用引物逆转录合成 eDNA.通过适当的酶切末端,并连接到相应的载体. 这种方法虽然实用.但是整个操作是在RNA水平上, 具有一定难度. 因此,本研究选用了SMART(SwitchingMecha— (CLONTECH公 nismAt5"endofRNATranscript)技术 司)来构建金荞麦高黄酮含量愈伤系的eDNA文库. SMART技术能以5Ong总RNA为最小起始材料,利 用PowerScriptTM逆转录酶f为具有点突变的MMOL— LV逆转录酶,无RNaseH活性)的SMART特性(在 mRNA反转录结束时自动在第一链eDNA末端添加 3个C的特性),自动地将两端接头同时加在全长单 链eDNA上.随后用接头引物进行LD—PCR合成 eDNA第二链,通过sfjI酶切末端,并连接到相应的 载体上.该方法减少了RNA降解的机会,避免了 mRNA的纯化,甲基化,接头平端连接等繁琐的操作, 简化了建库程序.并消除了基因组DNA和无polyA 的RNA污染,有效地保证了eDNA的完整性与覆盖 度,使最终获得的文库为高比例全长性文库l鲫u金荞麦 eDNA文库重组率达到98%,库容量为1.2xl0,插入 片段最大可达2kh,并从文库中检测到了低峰度表 达,对植物次生代谢有重要调控作用的R2R3Myb转 录调控因子P基因,不仅可以保存野生金荞麦的优异 基因资源,而且为克隆金荞麦类黄酮代谢途径中的主 要基因并进一步对该代谢途径进行分子调控打下了 坚实的基础. 参考文献: l1l刘光德,李名扬,祝钦泷,等.资源植物野生金荞麦的研究进展fJJ.中 国农学通报,2006.22(10):380—389. [2】艾群,下斌,王国清.金荞麦制剂的抑菌研究[JJ.黑龙江医学, 2002,26(9):666. [3】Pui—KwongChan.金养麦体外抑制肿瘤细胞生长的研究[JJ'中西医结 合,2003,1(2):128—131. [4】陈洁梅,顾振纶,梁中琴,等.金荞麦Fr4的抑瘤作用研究[JJ'中国野 生植物资源,2002,21(4):48—5O. 【5I陈晓锋J颐振纶,杨海华等.金荞麦Fr4对小鼠lewis肺癌细胞MMP29, TIMP21蛋白表达的影响fJ].苏州大学(医学版),2005,25(3): 383—386. [6】林洪生.金荞麦抗肿瘤研究进展[JJ_中西医结合,2004,2(1):72— 74. 17】甘烦远,郑光植.Selectionofhighyieldlineinplantcellculture.For- eignMedicalSciences[J].P/wttMedicineVolume(国外医药?植物药 分册),1990,5:10—15. 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