[word格式] 钩端螺旋体liprmA基因的表达及其产物的纯化与功能分析
钩端螺旋体liprmA基因的表达及其产物的
纯化与功能分析
遗传HEREDITAS(Beijing)27(5):792,796,2005研究
钩端螺旋体liprmA基因的表达及其
产物的纯化与功能分析
孙艳菊’,周忠卫’,姚建秀’,孙体昌,许琰艳’,文
(1中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京100101;
2北京科技大学土木与环境工程学院,北京100083)
雅’,鲍时来’
摘要:以钩端螺旋体基因组DNA为模板,通过酶联聚合反应(PCR)得到钩端螺旋体中prmA的同源基因liprmA
的全基因编码序列,并克隆到原核表达载体pET22b中.通过优化大肠杆菌培养和诱导条件,含目的蛋白的融合蛋
白可溶表达量达到40mg/L,约占菌体总蛋白的40%.经Ni—NTAHisBind亲和柱纯化,得到纯度大于95%的目的
蛋白.氨基酸序列同源性分析显示liPrmA与原核生物和真核生物的核糖体蛋白L11甲基化转移酶的功能域一级
结构高度一致;活性分析显示.纯化的liPrmA有钩端螺旋体核糖体蛋白L11甲基化转移酶的活性.
关键词:钩端螺旋体甲基化转移酶;钩端螺旋体;基因表达;纯化;大肠
杆菌
中图分类号:Q78文献标识码:A文章编
号:0253—9772(2005)05—0792—05
GeneExpression,Purificationand
FunctionalAnalysisofliprmA
SUNYan—Ju,ZHOUZhong—Wei’,YAOJian—Xiu,SUNTi—Chang,
XUYah—Yan.WENYa’.BAOShi—Lai
(1InstituteofGeneticsandDevelopmentalBiology,OhineseAcademyofSciences.Beijing100101,China
2UniversityofScienceandTechnologyofBeijing.Beijing100083.China)
Abstract:Leptospirainterrogans(Linterrogans)genomicDNAwasusedastemplatetoamplifythefull—lengthgene
forribosomalproteinL11methyItransferase(f『尸
m1A)byPCR.ThepET22b一/liprmAexpressionplasmidwassuccess—
fuIlyconstructedinEscherichiacoil(E.coil)strainTOP10andconfirmedbyrestrictionenzymedigestandsequen—
cing.ThroughoptimizingexpressionoftherecombinantIiPrmA一
6xHisfusionproteininexpressionhostEcoil.BL21.
theyieldofsolubletargetproteinreached40mg(1iterculture),
TheLiPrmAwaspurifiedtoapparenthomogeneityin
asinglestepusingNi—NTAHisBindchromatographyAminoacidhomolog
ousanalysisshowedthatIiPrmAsharedsig—
nificantidentitywithotherprokaryoticPrmAandeukaryoticputativePrmAi
nthecatalyticregionincludingAdoMetbind—
ingdomainMethylationactivityexperimentsshowedpurifiedliPrmAwasab
letocatalyzetheribosomalproteinL11Of
adenosyl—methionine( L.interrogansmethylatedunderthepresenceofS—
AdoMet)
Keywords:ribosomalproteinL11methyltransferase;Leptospirointerrog~n
s;geneexpression;purification;Esche—
richiacolf
核糖体是蛋白质合成的细胞器,原核生物的核
糖体是由rRNA和核糖体蛋白两部分组成.核糖体
蛋白正常发挥作用是核糖体保持功能正常的关键因
素:.通过研究人们发现,核糖体蛋白L11是一个
收稿日期:2004—09—06;修回日期:2004—10—21
作者简介:孙艳菊(1972),女,硕士研究生,专业方向:生物化工
通讯作者:鲍时来(1964),男,副研究员,研究方向:蛋白质甲基化转移
酶结构和功能,DNA损伤与修复.E-mail:slbao@geneticsaccn;Te
86—10—64889350
5期孙艳菊等:钩端螺旋体liprmA基因的表达及其产物的纯化与功
能分析793
重要的核糖体蛋白,其功能包括体内胁迫应答一,
核糖体亚基联合,翻译停止,在人体内能增强
P53(肿瘤抑制蛋白)的稳定性和活性一?等,而L11
的功能受多种翻译后修饰的调控,其中甲基化
是最经常发生的调控方式之一.目前的研究普遍认
为核糖体蛋白L11甲基化转移酶(PrmA)是细菌中
惟一确认催化L11甲基化的酶0,它负责将9个甲
基转移至L11的N末端结构域.截止目前尚未有
PrmA作用机理的报道.
钩端螺旋体(Leptospirainterregans)感染引起
的钩虫病是世界上广泛传播的人畜共患疾病之一,
症状从感冒到多器官功能衰竭的weil’S症一”j.随
着分子生物学技术的发展,人们对该病的研究重点
放在了基础研究和应用研究上?j.我国国家人
类基因中心南方研究中心于2002年率先完成了钩
端螺旋体全基因组的测定0,为深入研究钩端螺旋
体和该病的发病机理及治疗打下了良好的基础.钩
端螺旋体中prmA同源基因,liprmA(LA1391,
AE011318),由第一条染色体编码,基因编码区不含
有内含子.本文报道了liprmA和L11在钩端螺
旋体中的同源基因『『L11(NC一004342)的克隆及其
在大肠杆菌中的表达,生化实验证明所表达的liPr—
mA蛋白确实具有催化?L11甲基化的活性,这为进
一
步研究它们的相互作用机理及钩端螺旋体IiPrmA
的功能奠定了基础.
1材料和方法
1.1菌株与质粒
大肠杆菌TOP10,BL21和钩端螺旋体基因组
DNA由本研究组提供.质粒pET22b和pET28a购
自Novogen公司.
1.2试剂,酶与仪器
[.H]标记的s一腺苷一L.甲硫氨酸([.H]AdoMet)
购自PerkinEImerLifeSciences公司;NAMP100
Amplify试剂购自AmershamBiesciences公司;Ni—
NTAHisBind介质购自Nevagen公司.
1.3方法
1.3.1liprmA和f『L11基因的扩增及鉴定
用PCR方法扩增IJprmA和『『L11基因.根据
国家人类基因中心南方研究中心公布的钩端螺旋体
liprmA(AE011318)和J『L11(NC一004342)基因序列,
各自设计并合成一对引物.liprmA上游引物为5一
AACATATGAGATATAGAGAAATCATATTAAG一3,含
有NdeI酶切位点;下游引物为5”-AACTCGAGTC—
CTTTTCTTTTCCATTCGATC一3,含有XheI酶切
位点.『『L11上游引物为5一CCGGATCCATG—
GCAGCAAAAAAAGTAGTAAAGCAGATC一3,含有
BamHI酶切位点;下游引物为5一AAAAGCTTCTA—
AGCCTCTACAGTGACGCCCATGGAGCG一3,含有
Hind?酶切位点.以钩端螺旋体DNA为模板,扩
增长度为903bp的liprmA和429bp的『『L11基
因.反应条件:95?预变性2min,再以94?变性30
S,低温复性(1iprmA55?复性40S,『『L1165?复性
30S),72?延伸90S循环30次,最后72?10min
补平.PeR产物都用EcoRI进行酶切鉴定.
1.3.2liprmA和胜11重组质粒的构建与鉴定
liprmAPCR扩增产物和pET22b质粒分别用
NdeI和XhoI双酶切,『『L11PCR产物和pET28a
质粒分别用BamHI和Hind?双酶切,目的片段经
柱离心式胶回收试剂盒回收后,用T4DNA连接酶
连接,连接产物用CaCI法转化大肠杆菌(E.coli)
TOP10,阳性克隆用酶切法做初步鉴定后,再经序列
测定进一步确定构建结果.构建好的质粒分别命名
为pET22b/liprmA和pET28a/『『L11.
1.3.3质粒DNA的提取,酶切,回收,连接,转化
参照分子克隆实验手册.
1.3.4pET22b/liprmA和pET28a/liL11重组基因
在大肠杆菌中的表达
将pET22b/liprmA和pET28a/liL11的重组质
粒用CaCI2法转化E.celiBL21,含pET22b/liprmA
重组子的转化产物涂布含100ug/mL氨苄青霉素的
LB固体培养基平板,含pET28a/liL11重组子的转
化产物涂布含50pg/mL卡那霉素的LB固体培养
基平板,37?培养过夜.分别挑取平板上单克隆菌
于含相应抗性的液体LB培养基中,37?振荡过夜,
按1:100的比例转接至含相应抗性的液体LB培
养基中,37?振荡培养至OD?为0.6时,含
pET22b/liprmA重组子的菌体用0.6和0.8mmoI/
L的IPTG诱导,20?培养8h后4?,12000rpm/
min离心15rain,收取菌体,用12%的SDS—PAGE电
泳鉴定表达情况;含pET28a/liL11重组子的菌体用
O.6mmol/L的IPTG诱导,25?培养8h后4?,
12000rpm/min离心15min,收取菌体.用15%的
SDS—PAGE电泳鉴定表达情况.表达蛋白分别命名
794遗传HEREDITAS(Beijing)200527卷
为IiPrmA和IiL11.
1.35菌体破碎
收取的菌体以1:100(g:mL)溶于Ni—NTAHis
Bind亲和柱平衡缓冲液中.IiPrmA用20mmoI/L
Tris,300mmol/LNaCI,5mmol/L咪唑,pH85;?L11
用50mmoI/LTris,300mmoI/LNaCI,pH8.0,在冰
浴条件下超声破碎,破碎后菌体4?,12000rpm
min离心40min,收取上清,4?保存.
1,3.6liPrmA的纯化
将IiPrmA超声离心上清用Ni—NTAHisBind亲
和柱进行纯化.采用pH8.0和8.5两个不同pH值
的缓冲液摸索纯化方法.平衡缓冲液:20mmoI/L
Tris,300mmoI/LNaCI,5mmoI/L咪唑;冲洗缓冲液
I:20mmoI/LTris,300mmoI/LNaCI,10mmoIL
咪唑;冲洗缓冲液?:20mmoI/LTris,300mmoIL
NaCI,100mmoI/L咪唑;洗脱缓冲液:20mmoIL
Tris,300mmoI/LNaCI,300mmoIL咪唑.用12%
的SDS—PAGE检测各条件下目的蛋白纯度.
1.37IiPrmA酶活鉴定
将2ug纯化的liPrmA和20uLliL11的表达上
清,1pL(0,55pCi)[.H]AdoMet,适量EDTA(pH
8.0)和PMSF混合并用超纯水补充使总体积至50
uL,混合液中EDTA和PMSF的终浓度都为5
mmoI/L.对照品1不力口liL11,又寸照品2不力口liPr—
mA,其余组分完全相同.3种混合液都在30?孵育
30min后加入SDS电泳上样缓冲液,95?煮5min,
15%SDS—PAGE电泳.电泳胶考马斯亮蓝染色脱
色后用信号放大试剂处理30min,干胶,压片,压好
的X光片在一80?曝光2d后冲洗?].
2结果
2.1liprmAPCR扩增产物,pET22b/liprmA和
pET28a/liL11的鉴定
ffprmAPCR产物用EcoRI酶切后产物用
1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定为300bp和600bp两
条带;pET22b/liprmA用NdeI和XhoI双切后,得
到910和5400bp两条带,用NdeI/BarnHI双切
得到58O/5700bp两条带,结果都与预期值相符,
图1所示.
pET22b/ffprmA和pET28a/IlL11序列测定结
果显示得到的克隆的基因序列与文献报道一致.
2.2IiPrmA和IiL11蛋白表达鉴定
重组质粒在大肠杆菌BL21中用不同浓度的
IPTG诱导表达后,菌体超声,沉淀和上清分别经
SDS—PAGE电泳及考马斯亮蓝染色后,和相同条件
下诱导的含空载体的菌体比较.
123456bp
?---—一??-
??-
—_一2OOO
1000 —--——
—?一一-——750
_?_-一5OO
_—?-一25O
图1liprmAPCR产物和重组质粒酶切鉴定的
琼脂糖凝胶电泳分析
1:PCR产物;2:EcoRI酶切PCR产物;
3:pET22b,liprmA重组质粒;4,5:pET22bliprmA分别
用NdeIBarnHI和NdeIXhoI双酶切;
6:DNA分子量marker.
Fig.1ldentificationandrestrictionanalysisof
liprmAPCRproductandclonebyagarose
gelelectrophoresis
1{PCRproduct;2:PCRproductdigestedbyEcoRI;
3:pET22bliprmARecombinantplasmid;
4:pET22bliprmAdigestedNdeI/BernHI;
5:pET22b/liprmAdigestedbyNdeIandXhoI;
6:DNAmarker
图2中明显看到含pET22b/liprmA的菌体诱导
后沉淀和上清中在35kDa处都多出一条蛋白带(箭
头所指),和用pET22b做载体时IiPrmA一6XHis融
合蛋白理论分子量一致,并且菌体用不同浓度的
IPTG诱导,上清中目的蛋白含量没有明显差异,所
以选用0.6mmoI/LIPTG,20?做为大量表达该蛋
白的条件.可溶蛋白表达量约占细菌蛋白总量的
40%左右,达到40mg/L.
kDa
972
662
430
31O
12345678g1O11
兰秘
图2liPrmA诱导表达的SDA?PAGE图
1:蛋白marker;2,3:分别为末诱导的pET22b上清,沉淀;
4,5:pET22b08mmol,LIPTG诱导上清,沉淀;
6,7:pET22bliPrmA未诱导上清,沉淀;
8,9:pET22b,’liPrmA08mmol/LIPTG诱导上清,沉淀;
10,?:pET22b/liPrmA06mmolLIPTG诱导沉淀,tc清.
Fig.2SDS-PAGEanalysisofexpressedliPrmA
jProteinmarker;2,3:Non—inducedpET22bsupernatant
andpellet;4,5:pET22bsupernatantandpelletafterinduced
by08mmoILIPTG;6,7:Non—inducedpET22bliPrmA
supernatantandpellet;8,9:pET22b/fiPrmAsupernatantand
pelletafterinducedby08mmol/LJPTG;10,l1:pET22b/liPrmA
pelletandsupernatantafterinducedby06mmol/LIPTG
5期孙艳菊等:钩端螺旋体liprmA基因的表达及其产物的纯化与功
能分析795
图3中明显看到含pET28a/liL11的菌体诱导
后上清中在18kDa处都多出一条蛋白带(箭头所
指).和用pET28a做载体时liL11—6xHis融合蛋白
的理论分子量一致.
kDa1234
兰l一?
20.2二===叠
图3IiL11诱导表达的SDA—PAGE图
1:蛋白marker;2:诱导的pET28a全菌:
3,4:pET28a/IiL11诱导超声沉淀,上清.
Fig.3SDS-PAGEanalysisofexpressedliU1
aftersonicated
1:Proteinmarker;2:pET28awholecellafterinduced;
3.4:pET28a/IiL11sonicatedpelletandsupernatant
afterindLuced
2.3liPrmA蛋白的纯化鉴定
比较不同条件下纯化结果,确定最佳纯化条件
为:平衡缓冲液:20mmoI/LTris,300mmoI/L
NaOI,5mmol/L咪唑,pH85;冲洗缓冲液:20
mmoILTris,300mmoI/LNaCI,10mmol/L咪唑,DH
8.5;洗脱缓冲液:20mmoILTris,300mmoIL
NaOI,100mmol/L咪唑,pH85.该方法目的蛋白
收率高,纯度高.将Ni—NTAHisBind亲和柱洗脱时
的峰分3段收集,各组分用12%SDS—PAGE电泳检
测纯度.凝胶经考马斯亮蓝染色脱色后结果如图4
(箭头所指为目的蛋白),洗脱峰纯度在95%以上.
kDa12345
972—d磷瞬
..,薰
430—舞
一————
310—
图4IiPrmA纯化后SDA-PAGE图
1:蛋白marker;2:牛血清白蛋白(15pg);
3,5:liPrmA洗脱组分.
Fig.4SDS-PAGEanalysisofpurifiedliPrmA
1:Proteinmarker;2:BSA(15pg):
3,5:ElutepeakofpurifledliPrmA
2.4liPrmA酶活鉴定
图5中1,4为SDS—PAGE胶考马斯亮蓝染色
后图片(分子量在35kDa处箭头所指为IiPrmA,分
子量在18kDa处箭头所指为?L11),5,8依次为1
--,
4干胶压片后X光片曝光冲洗图片.由图可以看
到当只有[.HIAdoMet和liPrmA存在或只有[.H]
AdoMet和?L11存在时,都没有发生甲基化反应,
[.H]AdoMet,IiPrmA和liL11同时存在才能发生甲
基化反应.证明liPrmA以[.HIAdoMet为甲基供
体,能催化使?L11甲基化.
kDa12348765
二=习——,20.
2二_:一一<1---
图5IiPrmA酶活鉴定图
1:蛋白marker;2:IiL11f:清加[.H]AdoMet:
3:纯化liPrmA加[.H]AdoMet;4:纯化liPrmA加
[.H]AdoMet和liL11菌体上清.
Fig.5AnalysisofliPrmAmethyItransferaseactivity
1:Proteinmolecularweightstandard:2:Supernatantwith
liL11plusLHAdoMet;3:PurifiedliPrmAplus
[.H]AdoMet;4:PurifiedIiPrmAplus
[.H]AdoMetandsupernatantwithIiL11
3讨论
用CLUSTALW(182)multiplesequence
alignment软件进行氨基酸序列分析.比较包括钩端
螺旋体在内的四种原核生物PrmA氨基酸全长序
列,IiPrmA(AAN48590),嗜热菌(Thermusther—
mophilus)PrmA(AAS80645),链球菌(Streptococ—
cusagalactiae)PrmA(AAN00829),大肠杆菌
(Escherichiacoil)PrmA(AAO76291),分析得知:氨
基酸一致性(identity)为29.44%,这说明原核生物
的PrmA结构和功能高度保守-20.21.比较IiPrmA
(AAN48590),拟南芥(Arabidopsisthaliana)PrmA
(BAB10722),人(Human)推断的PrmA(XP374839)
和加鼠(Mouse)PrmA(AAH65807)包括功能域在
内的10o个氨基酸序列,分析得知除AdoMet结合
功能域(DxGxGxGxL)高度保守外,氨基酸的一致性
很低.这说明物种由原核生物进化到植物和哺乳动
物的过程中PrmA功能域外的氨基酸受环境影响变
化很大.
大肠杆菌表达外源蛋白时,极易形成包含体,使
得纯化步骤繁琐,目的蛋白收率低.为此我们选择
20?做为诱导表达温度,增加了外源蛋白的可溶性
796遗传HEREDITAS(Beijing)200527卷
表达.此外,我们选用带有6个His标签的pET系
列载体做目的基因的表达载体,既保证了目的基因
高效转录与翻译,又简化了目的蛋白质的纯化步骤,
目的蛋白经过镍离子螯合层析柱一步纯化,纯度可
达95%以上.表达的融合蛋白中6xHis标签很小,
不会影响被纯化蛋白功能研究的研究.
参考文献(References):
[1]
[2]
3]
[4]
[5
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
DecaturWA,FournierMJrRNAmod…catiOnsandribosome
functionndsBiochemSc,,2002,27(7):344,351
ThakurtaDG.DraperDEContributionsofbasicresiduestori—
bosomalproteinL11recognitionofRNAJMolBiol,2000.295
(3):569,580
OchiKArelaxed(re1)mutantofStreptomycescoelicolorA3
(2)withamissingribosomalproteinlackstheabilitytoaccumu—
lateppGpp?A—factorandprodigiosinJGenMicrobiol,1990,
136(12)12405,2412
ZhangS,ScottJM,HaldenwangWGLossofribosomalpro—
teinL11blocksstressactivationoftheBacillussubtilistran—
scriptionfactorsigma(B)JBacterio1.2001.183(7)2316,
2321
WendrichTM,BlahaG,WllsonDN,MarahieIMA,NierhausK
HDissectionofthemechnismforthestringentfactorRelAMol
Cel,.2002.10(4):779,788
GotzF,FleischerC,PenCL,GualerziCOSubunitassocia—
tiondefectsinEscherichiacoilribosomemutantslackingpro—
teins$20andL11EurJBiochem,1989.183(1):19,24
TateWP,ShulzeH,NierhausKHTheEscherichiocellriboso—
malproteinL11suppressesreleasefactor2butpromotesre—
leasefactor1activitiesinpeptidechainterminationJBiol
them,1983,258(21):12816,12820
TateWP,DogninMJ,NoahM,Stoffler—MeilickeM.Stoffler
GTheNHz—terminaIdomainofEscherichiacolfribosomaIpro—
teinL11,itsthree—dimenslenaIIocationandItsroleinthebind.
ingofthereleasefactor1and2JBiolChem,1984,259(11):
7317,7324
DykeNV,XuW,MurgolaEJLimitationofribosomalprotein
L11availability/nvivoaffectstranslationterminationJMolBi—
ol,2002,319(2):329,339.
ZhangY?WolfGW,BhatK,JInA,AllioT,BurkhartWA.Xiong
YRibosomalproteinL11negativelyregulatesoncoproteinMDM2
andmediatesap53一dependentribosomal—stresscheckpointpathway
Me/CellBiel,2003,23(23):8902,8912
[11]BhatKP,ItahanaK,JinA,ZhangYEssentialroleofriboso—
malproteinL11mediatinggrowthinhibition—inducedp53activa—
tionEMB0J,2004,23(12):2402,2412
[12]GrosjeanH,BenneRModificationandeditingofRNAWash.
ington,DC:ASMPress,1998
[13]VanetA,PlumbridgeJA,GuerinMF.AlixJHRibosomalpro—
teinmethylationinEscherichiacoil:thegeneprmA,encoding
theribosomalproteinL11methyItransferase,isdispensable
Me,Microbio,,1994,14(5):947,958
[14JRebecaPlankab,DeborahDeancdOverviewoftheepidemio1.
ogy?microbiologyandpathogene—sisofLeptospirasppinhu—
mansMicrobesandInfection,2000.2(10):1265,1276
[15]KmetyE.DikkenFRevisedlistofLeptospiraserovarGronin—
gen:UniversityPress,1988
[16]HaakeDA,WalkerED,BlancoDRChangesinthesurfaceof
LeptospirainterrogansServargvi—ppotyphosaduring/nvitro
cultivationInfectionand『mmuny,1991.59(3):1131,1140
[17]RENShuang—Xi,FUGang,JIANGXiu?Gao,ZENGRong,MIAO
You—Gang,XUHal,ZHANGYi—Xuan,XIONGHui.LUGang.LU
Quan.JIAJia.TUYue—Feng.JIANG Ling?Feng,JIANGHong—
Ju—Xing,GUWen—Yi,ZHANGYue—Qing,CAIZhen.SHENGHal—
Hui,YINHal—Feng,ZHANGYi,ZHUGen—Feng.WANMa.
HUANGHong—Wei,QIANZhen,WANGSheng—Yue,MAWei.
YAOZhi—Jian,SHENYan,QIANGBe—Qin,XIAQi—Chang.GUO
Xiao—Kui.DanchinA,GironsIS.SomervilleRL.WENYu—
Mei,SHIMan—Hua,CHENZhu,XUJian—Guo.ZHAOGuo—Ping
UniquephysiologicalandpathogenicfeaturesofLeptospirain.
terrogansrevealedbywhole—genomesequencingNature,
2003,422(6934):888,893
[18]PollackBP.KotenkoSV,HeW,IzotovaLS,BarnoskiBL,
PestkaSThehumanhomologueoftheYeastproteinSkb1and
Hs17pinteractswithJakkinasesandcontainsproteinmethyl—
transferaseactivity.JBiolChem.1999,274(44):31531,
31542
[19]BaoS,QyangY,YangP,KimHW,DuH.BartholomeuszG.
HenkelJ,PimentalR,VerdeF,MarcusSThehighlycon—
servedproteinmethyl-transferase.Skb1.isamediatorofhy—
perosmoticstressresponseinthefissionyeastSchizosacchero—
mycespombeJBiolOhem,2001,276(18):14549,14552
[20]RychlewskiL,JaroszewskiL,LiW,GodzikAComparisonof
sequenceprofiles,strategiesforstructuralpredictionsusingse—
quenceinformationProteinScf,2000.9(2):232,241
[21]BujnickiJMSequence,structuralandevolutionaryanalysisof
prokaryoticribosomalproteinL11methyItransferasesActaMi—
crobiofPo,,2000,49(1):19,28