微流控芯片技术在基因
研究中应用
参考文献 3 讨 论 〔1〕 Ingelman SM . Phar macogenetics of cytochro me P450 and it s appli2 C YP2 E1 是细胞色素 P450 亚型中的重要成分 ,主要分布 catio ns in drug t herpy :t he past ,p resent and f ut re J . Trends Phar 2 于人和鼠等动物的肝脏组织 。C YP2 E1 参与 70 多种低分子 ( ) macol Sci ,2004 ,25 4:193 - 200 . 物质代谢 ,其中大部分为前致癌物或前毒物 ,小部分是临床药 〔2〕 雷霆雯 , 李红梅 , 许庆忠 , 等. 大青叶对 C YP1A1 酶活性及转录〔8〕( ) 水帄影响J . 中国公共卫生 ,2006 ,22 10:1241 - 1242 .物。本实验结果显示 ,漏芦对 C YP2 E1 酶活性有浓度依赖 〔3〕 李峰 , 倪润洲 , 肖明兵. 大鼠 肝 细 胞 原 代 培 养 技 术 因 素 的 探 讨 性抑制作用 , 抑 制 率 最 高 可 达 50 %以 上 , 并 下 调 其 C YP2 E1( ) J . 南通大学学报 :医学版 ,2006 ,26 1:43 - 44mRNA 表达 ,提示漏芦是通过降低 C YP2 E1 的转录水帄而产 α〔4〕 杨静 ,彭仁绣 ,于皆帄. 18- 甘草酸下调“胶原蛋白凝胶三明治” 生抑制作用 。漏芦对 C YP2 E1 酶活性的抑制可能在 3 方面产 培养的大鼠肝细胞 P450 酶活性及 mRNA 的表达 J . 中国药理 () 生影响 : 1C YP2 E1 主要通过催化相对分子质量低的前致癌 ( ) 学与毒理学杂志 ,2001 ,15 2:155 - 158 . 物如亚硝胺类和偶氮化合物 N - 亚硝基二甲胺等去烷基 、去 〔5〕 李伟荣 ,董静 , 宓穗卿. 大鼠肝微粒体细胞色素 P450 含量的影硝基反应使之转变为致癌物 ,增加机体患肿瘤的机率 。漏芦 ( ) 响J . 广东医学 ,2005 ,27 9:1093 .抑制 C YP2 E1 活性能减少前致癌物活化 ,降低对致癌物的暴 〔6〕 Peng RX ,L ei SB , Gao P. The capactiy of drug metabolism in Chi2( ) 露危险 ,具有化学性预防肿瘤的作用 。2C YP2 E1 是肝的特 nese fetal livers ?. Metabolism of et hylmo rp hine aminopyrine and 〔9〕异性功能酶,肝脏是外源物质代谢的器官 ,一些小分子量的 ( ) aniline J . Asian Pac J Phar macol ,1990 ,5 1:13 - 18 . C YP2 E1 底物如氟烷 、四氯化碳等在 C YP2 E1 催化下生成具 〔7〕 Zhang Q Y , Dunbar D , Kaminsky L S. et al . Characterizatio n of 有肝脏毒性的活性中间产物 ,漏芦通过抑制 C YP2 E1 活性可 mo use small intestinal cytochro me P450 exp ressio n J . Dru g 减少这些毒性物质生成 ,在预防与治疗肝损伤方面可能有一 ( ) Metabolism and Dispo sitio n ,2003 ,31 11:1351 - 1360 . () 定作用 。3C YP2 E1 参与部分药物代谢如异烟肼 、乙酰氨基 〔8〕 周宏 灏. 遗 传 药 理 学 J . 2 版. 北 京 : 科 技 出 版 社 , 2001 : 53 -酚等 。本实验结果提示 ,漏芦合并使用以 C YP2 E1 为底物的 122 . 药物要注意漏芦可能降低代谢速度 ,长期大剂量使用易引起 〔9〕 Xiao bo Man , Liang Tang , Xiuhua Qiu , et al . Exp ressio n of cy2药物蓄积而引起中毒 。 tochro me P4502 E1 gene in heaptocelluar carcino ma J . Wo rld
( ) Jo urnal of Gast roenterology ,2004 ,10 11:1565 - 1568 .
)( 文涛编辑 赵淑艳校对 收稿日期 : 2006212201
【综述】( ) 文章编号 : 100120580 20070720829203 中图分类号 : R 446 文献标志码 : A
3微流控芯片技术在基因分析研究中应用
王翠娟 ,邵华 ,张放
( ,在此基础上容易制成功能齐全的便携式仪器 , 片上成为可能 20 世纪 90 年代初 ,以微机电加工技术 micro2elect ro me2
( ) chanical systems ,M EMS为基础的微型全分析系统 miniat ur2可用于各类现场分析 。原则上 ,微流控芯片可应用于各个分
μ ized total analysis systems , 或 micro total analysis systems ,2析领域 ,如生物医学 、新药物的合成与筛选 、食品和商品检验 、
) TAS,在近 10 余年中已经发展为当前世界上最前沿的科技 环境监测 、刑事科学 、军事科学和航天科学等其他重要应用领
μ() 领域之一 。2TAS 系统也被称为芯片实验室 lab2o n2a2chip , 域 ,其中生物分析是热点 。目前其应用主要集中在核酸分离 〔1〕 是生物芯片的最终目标。该技术是将化学 、生物学等领域和定量 、DNA 测序 、基因突变和基因差异表达分析等 。另外 , 所涉及的样品制备 、生物与化学反应 、分离和检测等过程缩微 蛋白质的筛分在微流控芯片中也已有报道 。本文拟对微流控 或基本缩微到一块几帄方厘米的芯片上 ,用以完成不同的生 芯片的概念和特点作简要介绍 ,并对近年国内外学者利用微
物或化学反应过程 ,并对其产物进行分析的技术 ,是一个微而流控芯片进行基因分析的研究进展作一综述 。 全的系统 。与相对应的宏观分析方法比较 ,该系统有很多优 1 微流控芯片技术在基因分析中的应用点 。微米级通道中的高导热和传质速率及缩小的结构尺寸使 ( 111 聚合酶链反应 聚合酶链反应 Polymerase Chain Reac2其具有极高的效率 ,由于微流控分析的试样及试剂已降低到 ) tio n , PCR是一种对核酸分子进行体外扩增的方法 , 已经广 微升水帄 ,减少了分析费用和贵重生物试剂的消耗 ,同时减少 泛应用于生物医学各个领域 ,反应的主要操作过程在 3 个温 μ了环境污染 。2TAS 可分为芯片式和非芯片式两大类 ,从文 度区间重复循环 ,经过酶促反应扩增特定的 DNA 片段 ,扩增献和 商 业 开 发 看 , 芯 片 式 是 发 展 的 重 点 。其 中 在 芯 片 式 后的产物可用于诊断疾病 、检验组织或血样中的特殊细菌或 μ2TAS中 ,依据芯片的结构和工作原理又可分为微流控芯片 病毒 。常规的 PCR 过程需要制样 、扩增及检测等步骤 ,既费 ( ) μ和微阵列芯片 。目前微流控芯片 microfludic chip 是2TAS 时又费力 ,而微流控芯片技术用于 PCR 扩增及相关检测时 , 中最活跃的领域和发展前沿 ,用微加工技术制作的微流控芯 既能简化操作步骤 ,又能显著提高检测效率 。目前 ,反应池内 片部件的微小尺寸使多个部件与功能集成在数帄方厘米的芯 固定扩增式 PCR 和连续流动式 PCR 已经成为芯片上 PCR 扩 〔2〕 增的 2 种主要形式。前者基于静态反应 ,通过反应池内温( ) 3 基金项目 : 国家自然科学基金 30471429 ; 山东省科技攻关项目 度的周期性变化实现扩增 ,后者是依靠生物样品顺序流过 3 ( )2004 GG2202153 〔3〕个不同的温度区实现扩增 。1996 年 Kopp 等首次提出连续 作者单位 : 山东省职业卫生与职业病防治研究院 ,济南 250062 ( ) 流动式微流 控 PCR 芯 片 , 其 核 酸 的 扩 增 过 程 均 在 流 动 中 进 作者简介 : 王翠娟 1979 - ,女 ,山东人 ,硕士在读 ,主要从事职业 卫生与环境卫生工作 。行 ,流动式芯片下面分别有 95 ?、72 ?、60 ?3 个不同的恒温 通讯作者 : 邵华
( ,样品流经此 3 个区域即能实现自动在同一块芯片上完 区域 113 多态 性 检 测 单 核 苷 酸 多 态 性 single nucleotide poly2
) 成 PCR 的变性 、退火 、延伸 3 步反应 , 大大缩短了扩 增 的 时 morp hism , SN P就 是 人 类 基 因 组 中 物 理 图 谱 的 理 想 遗 传 标 间 ,同时所需的反应试剂也比传统的 PCR 少 。此后 ,很多科 记 ,能满足对代谢 、生长和疾病相关基因的定 位 。SN P 在 人
学家在此项研究的基础上 ,对连续流动式 PCR 技术进行了更类基因组中出现的频率非常高 ,帄均每 500,1 000 个碱基对〔12〕〔4〕中就有一个 SN P ,估计其总数在 300 万个以上。基因多态 进一步的改进 ,使其更加微型化 。1998 年 , Manz 等首次应
用玻璃基微流控芯片对 176 bp 的片段实现了体外连续放大 , 性是人类各种可遗传变异中常见的现象 ,主要表现为长度和 完成了 20 次扩增 ,最短仅需要 115 min ,最长需要 1817 min 。 序列多态性两个方面 。长度多态性包括大片段 DNA 插入或 〔5〕 缺失引起的基因突变以及高度重复序列中小卫星或微卫星位Schneegass用流动型 PCR 扩增芯片在 35 min 内成功扩增了 〔6〕点的重复串联数目不同而引起的多态性 ; 而序列多态性则来 106 ,379 和 700 bp 的 DNA 片段 。姚李英等采用聚甲基丙
( ) 源于单碱基的替换 、插入或缺失 ,也叫基因的点突变 。病态下 烯酸甲酯 PMMA高聚物
代替硅和玻璃作为微流控芯片
许多突变涉及到大范围的基因缺失或复制 。如杜氏肌营养不的基片材料 ,美国 Kloehn 公司的精密注射泵作为进样系统 ,
() 良 DMD是一种 X 染色体连锁的隐性遗传病 ,60 %的患者可 在 10 nl/ s 的进样速度下 ,在 20 个循环的 PCR 微流控芯片上
伴有抗击萎缩蛋白基因的缺失 ,且主要发生在 9 个突变热点 进行了 DNA 扩增实验 ,实验仅耗时 15 min ,实验时 3 个温区
的温度分别为变性 104 ?,复性 60 ?,延伸 82 ?。区 。SN P 检验方法主要是以 PCR 为基础 ,通过电泳技术分辨
DNA 片 段 的 各 种 差 异 来 进 行 基 因 分 型 。 碱基差 异 造 成 的 但在多个样品连续扩增时 ,由于通过人工换样 ,降低了单 〔13〕 Cantafora 等通过 Agilent 2100 芯片分析仪 ,以低密度脂蛋位时间扩增的样品数 ,也增加了交叉感染的可能 。为克服以 ( ) 〔7〕白受体基因 D19s394 位点的四核苷酸重复序列 AAA G为遗 上缺陷 ,刘金华等研制了具有 35 个扩增循环的螺旋通道微 传标记 ,对 70 名家族性高胆固醇血症携带者和 100 名正常人 流控 PCR 玻璃芯片 ,在 26min 内成功扩增了质量浓度仅为 10 进行了基因分型 ,并进行了家族性连锁分析 ,其核心序列的重 ng/ ml 的 6012 bp 的 DNA 。在芯片内液流由内向外流 ,减少 ( 复数目为 0,17 不等 ,等位基因判断的
偏差为 ?016, 了反应液在微通道中流动时的分散和阻力 ,将小孔径石英毛) ?0175bp 。Liu D Y 研究组将 PCR 扩增与毛细管电泳分离集
() 成在玻璃微流控芯片上 ,用激光诱导荧光 L IF检测 ,建立了 ( ) 细管作为 顺 序 注 射 系 统 SI的 连 接 通 路 , 将 死 体 积 降 低 至( ) 一个用于严重急性呼吸系统综合征 SARS冠状病毒的实验 013 nl ,从而完成了扩增过程中微升级样品的自动控制 ,实现 系统 ,和常规的 PCR2帄板凝胶电泳比较 ,该系统检测灵敏度 了在芯片上进行多个样品的连续自动扩增 、微升级样品的自 〔14〕提高 100 倍 。宋沁馨等用芯片电泳快速检测人 p53 基因 动换样 、连续 PCR 扩增和微通道洗涤等功能 ,样品间无交叉 外显子 8 上的突变点 ,采用芯片电泳检测结合特异性引物单 污染 。由此可见 ,利用流通式微流控 PCR 芯片已成功地实现 ( ) 碱基延伸法 SB E,除去 SB E 反应时间 ,芯片电泳可在 100 s 〔15〕了 PCR 的快速扩增 ,其优点是扩增速度快 ,操作简便 ,使用样 内检测出结果 , 简便而又准确 。L u C Y 等在 PCR 和限制
性核酸内 切 酶 消 化 操 作 后 , 用 Agilent 2100 芯 片 分 析 仪 的 品和试剂少 ,芯片可以重复使用 。 DNA500 和 DNA1000 试剂盒相关程序分析 DNA 点突变 ,与 112 核酸分离与测序 微流控芯片分析在生命科学领域的 主传统的用凝胶电泳限制性片段长度多态性分析方法相比 ,优 要应用对象之一是核酸分析 。由于在微通道条件下 ,施加 〔16〕点为灵 敏 度 高 重 复 性 好 。汪 洋 等利 用 微 流 控 芯 片 检 测 电场产生的焦耳热效应低 ,注入的试样量少 ,分子扩散 程 度p16 基因的异常甲基化 。通过对肺癌患者血浆标本的检测 , 低 ,因此 ,微流控电泳分析在核酸诊断分离中的分辨能力远远 使病人血浆中的 p16 基因甲基化的异常改变可能成为辅助肺
癌早期诊断和高危人群筛选的分子标记物 ,以期建立一种崭 好于帄板凝胶电泳 。微芯片的快速高质量的分离效能在寡核 〔17〕新而可靠的早期肺癌临床诊断标准 。Steven 等采用以聚 苷酸 、DNA 、RNA 片段分析以及基因表型和测序应用中得到 ( ) () ( 碳酸酯 PC制作的连接酶检测反应器 L DR及 PMMA 聚甲 充分反映 。微芯片上的 DNA 基因型分析可以迅速完成基因 ) 基丙烯酸甲酯制作的微通道为主要部件的微流控芯片 ,对大 鉴别 ,显著提高其在基因组学 、诊断学 、遗传药理学 、法医学检 量样本 DNA 中可能发生点突变的序列进行了检测 , 达到了 验方面的性能 。1994 年 , Effenhauser 最早在微流控芯片上进 预期的效果 ,处理一个样本只需要约 1911 min 。 行 DNA 分离 ,分离了长度为 10,15 bp 的 DNA 低聚物的混114 其他 除了应用于基因多态性检测和 DNA 测序 ,芯片 合物 。尔后又陆续在微芯片电泳上进行 DNA 分离的基础性 电泳还可通过 PCR 产物分析进行外源性病原体基因的快速 〔8〕研究工作 。Kaji等人应用纳米技术 , 在石英芯片的微通道 检测 ,并具有较高的灵敏度和特异性 。针对病原微生物基因() 内制作出纳米柱 直径 100,500 nm ,高约 500,5 000 nm,使 组的特征性片段 、染色体 DNA 的序列多态型 、基因变异的位 用这种纳米柱作为筛网 ,在直流电场下可以有效地分离 DNA点及特征等 ,
和选择合适的核酸探针 ,经 PCR 扩增后检 〔9〕() 片段 1,38 kb以及较大的 DNA 分子 。Baba 等采用步进 测 ,就能获得病原微生物 种 属 、亚 型 、毒 力 、抗 药 、致 病 、同 源线性梯度凝胶方式 ,借助于筛分介质中孔径的差异 ,明显改善 性 、多态型 、变异和表达等信息 ,为疾病的诊断和治疗提供一 了 DNA 片段的分离 。近 10 年来 ,随着微流控分析芯片在技 个很好的切人点 。有关该技术的应用已有报道 ,应用微流控 术上的不 断 完 善 和 发 展 , 微 流 控 分 析 芯 片 系 统 所 能 分 离 的 芯片可同时检测多种病原微生物核酸的 PCR 产物如乙型肝 DNA 片段的长度也在逐步扩大 ,可完成对 DNA 片段的测序
和遗传物质的分离 、分析 ,并且出现了可同时进行帄行分析的 〔10〕多通道阵列芯片 。Mat hies 等在直径 150 mm 的圆盘式玻
璃芯片上刻蚀了 96 条长 16 cm 的逶迤型毛细管电泳阵列通
( ) ( ) ( ) 道 ,完成了 4 色 M13 标准 DNA 的帄行分离检测 ,测序长度可炎病毒 HBV、丙型肝炎病毒 HCV、免疫缺陷病毒 HIV、 〔11〕〔18〕 达 500 个 bp ,分离时间却少于 30 min 。L agally等开发出一 梅毒等 ,如卞茂红等应用 PCR2微流芯片检测无偿献血者
的初 、复检合格血液的混合血清 HBV DNA ,对献血者进行更 种集成化 DNA 分析系统 , 首次在单个芯片上完成了聚合酶
( ) 为有效的筛选 ,从微流芯片法重复定量检测结果来看 ,该方法 链反应 - 电泳 PCR2CE的集成 ,建立了集取样 、PCR 扩增和
CE 分离分析于一体的微系统 ,不仅系统功能更强大 ,而且装 的重复性好 ,结果稳定且特异性强 ,检测速度快 ,一般 3 h 左
右能完成操作的全过程 ,有助于减少甚至避免输血传播疾病 置也更紧凑 、更完善 。Medintz 等用 96 通道圆盘式阵列芯片 〔19〕 的发生 。Noer holm 等研制了一种高分子材料的微流控 -毛细 管 电 泳 进 行 DNA 测 序 , 500 bp 分 离 测 序 时 间 少 于 30
min ,总错检率小于 1 % 。微阵列芯片 ,可以用于核酸杂交并对其进行实时检测 。该芯
〔7 〕 刘金华 ,殷学锋 ,方肇伦. 螺旋通道微流控 PCR 芯片连续自动扩增 片具有一个进样口 ,一个可容纳 1 000 点微阵列的杂交室 、一 () DNA 片段的研究J . 高等化学学报 ,2004 ,25 1:30 - 34.个废液池和一个通气口 。探针 DNA 分子是通过微阵列技术 〔8 〕 Knji N , Tezuka Y , Takamura Y , et al . Separatio n of lo ng DNA印制到基体表面的 ,所要分析的样品由微流控体系加入并与 molecules by quartz nanopillar chip s under a direct current elect ric 探针反应 。该技术吸收了微流控与微阵列两者的优点 ,微流 ( ) fieldJ . Anal Chem. 2004 J an 1 ;76 1:15 - 22 . 控体系可以通过调节温度自动控制与微阵列 DNA 反应的样 〔9 〕 Zhang L ,Dang F ,Baba Y. Step wise gradient of linear polymer ma2
t rices in microchip elect rop ho resis fo r high resolutio n separatio n of 品量 ,同时吸取了微阵列技术中可通过荧光信号对杂交进行 ( ) DNAJ . Elect ro p ho resis ,2002 ,23 14:2341 - 2346 . 实时监测的长处 。 〔10〕 Medintz IL , Paegel BM ,Mat hies RA. Microfabricated capillararray 2 展 望 elect rop ho resis DNA analysis systems J . Chro mato grap hy A , 经过十几年的发展 ,微流控分析芯片技术在基因分析中 ( ) 2001 ,924 1 - 2:265 - 270 .
的应用越来越广泛 ,并不断取得积极和具有突破性的成果 ,并 〔11〕 L agally E T ,Simp so n PC ,Mat hies RA. Mo nolit hic integrated DNA
amplificatio n and capillary elect rop ho resis analysis systemJ . Sen 2 由于自身突出的优点 ,可能在不远的将来成为基因分析的主 ( ) so rs and Act uato rs B ,2000 ,63 3:138 - 146 . 要工具 ,其技术可以为后基因时代的基因组学研究提供一个 〔12〕 Sherry S T , Ward M H , Kholo dov M ,et al . db SN P :t he NCB I data 更为强大的帄台 。但在一项新技术高速发展的同时 ,既存在 base of geneticvariatio n J . Nuleicacids Res ,2001 ,29 :308 - 311 . 着优势 ,也面临着限制其发展的不利因素 。目前 ,微流控芯片 〔13〕 Cantafo ra A ,Blot ta I ,BruzzeSe N ,et al . Rapid sizing of micro sate2的集成度仍不够高 ,多数检测器的体积过大 ,实现集成化还有 llite alleles by gel elect rop ho resis o n microfabricated channels : ap2
plicatio n to t he D19 S394 tet ranucleotide repeat fo r co segregatio n 很长的路要走 。在目前加工条件下微流控芯片的成本较高 , st udy of familial hyper cholesterolemia J . Elect ro p ho resis , 2001 , 还难以满足有关成果推广应用的要求 。当前报道的大部分微 ( ) 22 18:4012 - 4015 . 流控芯片分析系统功能仍不够全 ,不包括试样的前处理功能 , 〔14〕 宋沁馨 ,李正帄 ,周国华 ,等. 用芯片电泳快速检测人 P53 基因外 如何解决实际试样的分析 ,更好地利用现有的微机电加工技 () 显子 8 上的突变J . 中国医科大学学报 ,2003 ,34 4:344 - 346. ( ) μ术 M EMS和2TAS 技术 , 发展实用性的芯片分 析 帄 台 , 需 〔15〕 L u C Y , Tao DJ , Yang To m ,et al . Detectio n of DNA mutatio ns as2
sociated wit h mitocho ndrial diseases by Agilent 2100 bioanalyzer 要进一步研究 。 ( ) J . Clinica Chimica Acta ,2002 ,318 12:97 - 105 . 参考文献 〔16〕 汪洋 , 邹丽娟 , 许 关 东 , 等. 微 流 控 芯 片 检 测 肺 癌 患 者 血 浆 中
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( ) tio n and separatio n systemsJ . Anal ytical Biotecho nlogy ,2001 ,12 物理进展 ,2004 ,31 12:1085 - 1089 . ( ) 1:92 - 98 . 〔17〕 Steven A. Soper , Masahiko Hashimoto , Cat herine Sit uma , et al .〔2 〕 Liu J , Enzelberger M ,Quake S. A nanoliter rotary device for polymerase Fabricatio n of DNA microarrays o nto polymer subst rates using U V () chain reactionJ . Electro phoresis ,2002 ,23 10:1531 - 1536. mo dificatio n p rotocols wit h int2egratio n into microfluidic platfo r ms 〔3 〕 Kopp MU ,de Mello AJ ,Manz A. Chemical amplification continuous2flowfo r t he sensing of low2abundant DNA point mutatio ns J . Met h 2 () PCR on a chip J . Science ,1998 ,280 5366:1046 - 1048. ( ) o ds ,2005 ,37 1:103 - 113 . 〔4 〕 Kopp UM ,de Mello J A ,Manz A ,et al. Chemical amplification : continu2〔18〕 卞茂红 ,张循善 ,刘淑均 ,等. PCR2微流芯片检测 HBV DNA 在血液 ous2flow PCR on a chip J . Science ,1998 ,280 :1046 - 1048. () 筛查中的初步应用J . 中国输血杂志 ,2005 ,18 1:14 - 16. 〔5 〕 Schneegass I , Bracutigam R , Kochler J M . Miniat urized flow2〔19〕 Noer holm M ,Bruus H ,J ako bsen M H ,et al . Polymer microfluidic t hro ugh PCR wit h different template t ypes in silico n chip t her mo2 chip fo r o n line mo nito ring of microarray hybridizatio ns J . L ab ( ) cycler J . L ab o n a Chi p ,2001 ,1 1:42 - 49 . ( ) On a Chip ,2004 ,4 1:28 - 37 . 〔6 〕 姚李英 ,祁恒 ,陈涛 ,等. 聚合酶链式反应微流控芯片的准分子激光 )() ( 制备和应用研究J . 高等化学学报 ,2006 ,27 3:428 - 431. 收稿日期 : 2006210226 郑新编辑 赵淑艳校对
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