实验五 蛋白质浓度测定方法比较

实验五 蛋白质浓度测定方法比较 一． 实验目的： 了解蛋白质浓度的测定方法(Lowry法、紫外线吸收法和考马斯亮蓝显色法)，并比较它们的优缺点。 二． Lowry法（Folin-酚法）： 1． 实验原理： OH－                    　  磷钼酸、磷钨酸 Pr+CuSO4    Pr-Cu络合物（紫红色）  　            蓝色复合物  蛋白测定范围：25-250ug/ml        测定波长：660nm 蛋白BSA  250ug/ml 2．试剂和器材： 3．操作方法： （1） 依次向各试管中加入试剂： 管号 1 2 3 4 5 6 7 待测1 待测2 BSA(ml) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 1.0 D.W(ml) 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 [Pr](μg/ml) 0 25 50 100 150 200 250     试剂甲(ml) 5.0室温反应10分钟(双缩脲反应) ↓ 试剂乙(ml) 0.5立即振摇,30摄氏度水浴20分钟 ↓ A660nm 0 0.068 0.140 0.256 0.355 0.535 0.651 0.302 0.303                     （2）以A660nm-[Pr] 作标准曲线 ： 4．实验结果： 从标准曲线上可求得待测蛋白浓度(平均)：116μg/ml 三． 紫外线（UV）吸收法： 方法一：作图法 1．实验原理：利用蛋白质在280nm的紫外吸收特性(蛋白测定范围：0.1～1mg/ml) 2．操作步骤：标准蛋白BSA  1mg/ml （1） 向各试管中依次加入各种试剂： 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 待测1 待测2 BSA(ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 4.0 4.0 0.15M NaCL 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 0 0 [Pr](mg/ml) 0 0.125 0.25 0.375 0.5 0.625 0.75 1     A280nm 0 0.066 0.142 0.220 0.292 0.397 0.443 0.595 0.085 0.060                       （2）以A280nm-[Pr]作标准曲线： 4．实验结果： 从标准曲线上可求得待测蛋白浓度(平均)：0.128mg/ml 方法二：公式法 分别测出待测蛋白A260、A280 蛋白质浓度（mg/ml）＝1.45A280-0.74A260 或蛋白质浓度（mg/ml）1.55A280-0.76A260 四． 考马斯亮蓝显色法（Brad-forol法）： 1． 实验原理： [ Pr ]          CBBG-250- Pr复合物          A595 测定Pr范围： 0~250ug/ml  标准蛋白BSA  250ug/ml 测定波长595nm 2．试剂和器材： 考马斯亮蓝试剂；标准蛋白质溶液：250μg/ml BSA；测试样品 试管及试管架，0.1及5ml吸量管，恒温水浴，722型分光光度计。 3．操作步骤： （1） 依次向各试管中加入各种试剂 管号 1 2 3 4 5 6 待测1 待测2 BSA(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 1.0 D.W(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 [Pr](μg/ml) 0 50 100 150 200 250     CBBG-250(ml) 5.0 A595nm 0 0.224 0.359 0.428 0.451 0.453 0.297 0.309                   （2）以A595-[Pr]作出标准曲线： 4．实验结果： 从标准曲线上可求得待测蛋白浓度(平均)：117μg/ml 五、试验分析： Lowry法是双缩脲法的进一步发展，是一种可靠的蛋白质含量测定法。优点是操作简便，灵敏度高，可测定范围25－250微克的蛋白质。缺点是有蛋白质特异性的影响，即不同蛋白质因酪氨酸，色氨酸含量不同而使颜色强调不同，标准曲线也不是严格的直线形式。要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。 紫外线吸收法大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。它的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。缺点是不同蛋白质中酪氨酸，色氨酸含量不一样，测定结果误差大；核酸有强烈干扰；蛋白质紫外吸收值与PH有关。 考马斯亮蓝法是检测生物制品总蛋白含量的理想方法，它方法简单，只需一种显色液；反应迅速，只需5分钟；干扰少。缺点是高浓度的EDTH,尿素，甘油等有干扰；PH值影响大；线性关系不好。