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脂成骨分化【摘要】目的建立小胎龄人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）的分离和培养方法，探讨hUCMSCs的成脂、成骨分化潜能。方法采用II型胶原酶和透明质酸酶消化法从胎龄12〜18w的流产胎儿脐带中分离hUCMSCs;流式细胞仪检测其免疫型;应用不同因子诱导hUCMSCs向脂肪细胞及成骨细胞分化并进行鉴定。结果体外培养的hUCMSCs呈长梭形，细胞形态均一;表达CD29、CD44、CD73、CD105、CD166;不表达CD34、CD45、CD40、CD40L、CD80、CD86、HLA❷❷DR;油红0、茜素红染色及RT❷❷PCR证实hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论建立了小胎龄hUCMSCs分离培养方法，证实其具有成脂、成骨分化潜能，有望成为细胞治疗及组织工程更为理想的种子细胞。【关键词】脐带间充质干细胞;免疫表型;脂肪细胞;成骨细胞间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）主要来源于成人骨髓，与成人骨髓MSC相比，来自于胎儿期的MSC具有更强大的扩增能力、免疫原性低及来源广泛等诸多优势。目前文献报道的人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）多取材于足月生产的胎儿脐带，而从人工流产的较小胎龄胎儿脐带中分离的hUCMSCs未见报道。本实验从胎儿脐带中分离hUCMSCs，初步研究其形态学、免疫表型及分化潜能等基本生物学特性。1材料与方法1.1材料DMEM/F12培养基、胎牛血清（Invitrogen,美国）；II型胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶、胰岛素、1❷布谆❷❷❷3❷惨於』❷黄嘌吟、吲哚美辛、B❷哺视土姿崮啤5.厝❷米松和抗坏血酸（Sigma，美国）；流式抗体（CD29❷❷FITC、CD44❷❷FITC、CD73❷❷PE、CD105❷❷PE、CD166❷❷PE、CD34❷❷FITC、CD45❷❷FITC、CD40❷❷FITC、CD40L❷❷FITC、CD80❷❷FITC、CD86❷❷PE、HLA❷❷DR❷❷PE）（eBioscience，美国）；RT❷❷PCR仪（StratageneMx3000p）。方法1.2.1hUCMSCs的分离、培养取自愿捐献的人工流产胎儿尸体（胎龄12〜18w）,酒精浸泡消毒，剪下脐带，PBS冲洗，剥离脐静脉及脐动脉。将wharton'sjelly剪成长度约5mm的组织块，加入分离液（DMEM/F12、10%FBS、0.01%II型胶原酶、0.05%透明质酸酶），在37°C、5%C02和95%空气的条件下消化过夜。1500r/min离心10min，用含10%FBS的DMEM/F12悬浮细胞，以5X103个细胞/cm2的密度接种。48h后首次换液，吸弃未贴壁细胞。当细胞生长至占培养皿底面积80%时，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化，按1：3的比例进行传代培养。1.2.2细胞免疫表型测定取第3代hUCMSCs,制成单细胞悬液。分别加入抗人CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、CD34、CD45、CD40、CD40L、CD80、CD86、HLA❷❷DR单克隆抗体，4°C孵育30min，流式细胞仪检测细胞表型分子阳性率。hUCMSCs成脂诱导分化①诱导过程：第3代细胞生长至占培养皿底面积80%时，将基础培养液更换为成脂诱导液（DMEM/F12、10%FBS、1口mol/L地塞米松、0.5mmol/L1❷布谆❷❷❷3❷惨於』❷黄嘌吟、100mmol/L吲哚美辛、10mg/L胰岛素），每3d换液。②油红O染色：成脂诱导第14天，吸弃诱导培养液，PBS冲洗，4%多聚甲醛室温固定1h，70%异丙醇清洗，油红O工作液室温染色10min，70%异丙醇洗去多余染料。③RT❷❷PCR检测：Trizol法提取空白组及诱导组细胞总RNA，逆转录生成cDNA后，进行RT❷❷PCR相对定量实验。检测脂肪诱导分化过程中的特异性蛋白PPAR❷拨迷❷0、7、14、28d表达量的变化。PPAR❷拨锰匾煨砸❷物（正向：CGAAGACATTCCATTCACAAG，反向：CTCCACAGACACGACATTC），GAPDH作为内参照（正向引物：GACAGTCAGCCGCATCTTC，反向引物：ACTCCGACCTTCACCTTCC）。反应条件95C，30s;58C，60s;72C，60s。40个循环。hUCMSCs成骨诱导分化①诱导过程：第3代生长至占培养皿底面积60%时将基础培养液更换为成骨诱导液（DMEM❷❷LG、10%FBS、50口g/ml抗坏血酸、10mmol/LB❷哺视土姿崮啤❷10❷❷8mol/L地塞米松）。每3d换液。②茜素红染色：成骨诱导至第14天，吸弃诱导培养液，PBS冲洗，95%乙醇室温固定10min，双蒸水冲洗，茜素红工作液37C孵育30min，双蒸水冲洗。③实时定量（RT）❷❷PCR检测：Trizol法提取空白组及诱导组细胞总RNA,逆转录成cDNA后，进行RT❷❷PCR相对定量实验。检测成骨诱导分化过程中的特异性蛋白Osteopontin在0、7、14、28d表达量的变化。Osteopontin特异性引物（正向：CGACGATGATGACGATGATG，反向：CGACTGTAGGGACGATTGG）。反应条件95C，30s;58C，60s;72C，60s。40个循环。2结果2.1hUCMSCs的形态学观察倒置显微镜下观察，原代培养细胞24h后逐渐贴壁，贴壁细胞90%伸展生长，呈长梭形，单核，含1〜3个核仁。传代细胞4〜6h即可贴壁，且传代后细胞形态趋于一致，呈放射或漩涡状排列。见图1。hUCMSCs的免疫表型检测hUCMSCs表达CD29、CD44、CD73、CD105、CD166;不表达CD34、CD45、CD40、CD40L、CD80、CD86、HLA❷❷DR（见图2）。本实验结果表明，脐带wharton'sjelly来源的hUCMSCs在免疫表型上与MSCs—致。hUCMSCs向脂肪细胞定向诱导分化加入成脂肪细胞诱导液后，细胞几乎停止繁殖，胞体增大，逐渐从长梭形变为椭圆形，7d左右细胞内出现脂滴。经油红O染色证实为脂性液体。RT❷❷PCR结果显示，诱导组PPAR❷拨帽泶锪克媾嘌❷时间而增加，14d时可达高峰。而空白组未见明显表达见图3。图1hUCMSCs细胞形态（倒置相差显微镜，X100）hUCMSCs向成骨细胞定向诱导分化成骨诱导7d左右，细胞形态逐渐向多角形转变。14d时细胞生长密集，显微镜下可见钙化结节，茜素红将其染成桔红色。RT❷❷PCR结果显示诱导组Osteopontin表达量随培养时间而增加，28d左右可达高峰。见图4。图2hUCMSCs（P3）表型分子CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、CD34、CD45、CD40、CD40L、CD80、CD86、HLA❷❷DR检测结果A：hUCMSCs成脂诱导7d,油红O将脂滴染成红色（倒置相差显微镜，X100）;B：RT❷❷PCR显示PPAR❷拨帽泶锪康木❷时变化。图3hUCMSCs成脂诱导分化鉴定结果A：hUCMSCs成骨诱导14d,茜素红将钙化点染成红色（倒置相差显微镜，X100）;B：RT❷❷PCR显示Osteopontin表达量的经时变化。图4hUCMSCs成骨诱导分化鉴定结果3讨论MSCs最初是在骨髓中发现的，具有特定的免疫表型特征。hUCMSCs不表达造血干细胞表型CD34、CD45，而表达CD29、CD44、CD73、CD105和CD166等，而CD73、CD105和CD166是目前比较公认的MSCs的表型分子。因此在免疫表型上可以界定hUCMSCs是一类hUCMSCs。对于hUCMSCs的免疫表型鉴定已有报道〔1〕，除上述抗原外hUCMSCs不表达HLA❷❷DR，表明异基因hUCMSCs移植不存在HLA屏障。本实验还分析了协同刺激分子B7❷❷1（CD80）、B7❷❷2（CD86）和CD40、CD40L的hUCMSCs的表达情况。T、B淋巴细胞的激活需要双重信号，CD28/B7和CD40/CD40L间的相互作用是T、B淋巴细胞最重要的第二活化信号，如果缺少第二信号，T、B淋巴细胞将不能被活化，从而产生“免疫无能”。本实验结果表明hUCMSCs不表达共刺激分子CD80、CD86和CD40、CD40L，从而进一步证实hUCMSCs的低免疫原性和较低的抗原提呈能力，有可能适应异基因个体间的细胞移植。在不同的培养条件下，hUCMSCs可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。PPAR❷拨檬侵❷肪分化过程中的标志性基因，在分化的表达，并且调控其他脂肪细胞特异性基因表达。普遍认为地塞米松、抗坏血酸、B❷哺视土姿崮频饶苡盏❷MSCs向成骨细胞分化。地塞米松在分化早期促进基质合成，后期以促进钙化为主，但地塞米松在促进成骨的同时能激活MSCs表面的糖皮质激素受体，使其向脂肪细胞分化，从而会减少向成骨细胞分化的相对量。胚胎期的MSCs具有更加强大的增殖及分化能力，可能基于其端粒长度的优势〔2，3〕。因此，较小胎龄hUCMSCs更能满足临床研究的需要。在细胞分离时，各个实验室所使用的胶原酶类型、浓度及消化时间各不相同〔4〜6〕，由于本实验取材自小胎龄胎儿脐带，其韧性及致密性较足月胎儿脐带小。所以采用0.01%11型胶原酶和0.05%透明质酸酶消化过夜的方法即可从脐带中充分分离MSCs°II型胶原酶与其他类型的胶原酶相比具有更强大的脐带消化能力〔7〕。透明质酸酶的使用可降低消化后细胞悬液的黏性〔1〕。临床研究中的MSCs主要来自于骨髓，骨髓中MSCs含量很少，约占骨髓单个核细胞总数的1/104〜1/105，并且其数量及分化潜能随年龄增加而降低。脐带wharton'sjelly来源的MSCs是新近发现的一类MSCs，有研究表明每厘米脐带中含有4X105个MSCs〔8〕。因此，其充足的数量、广泛的来源、更强的增殖分化能力以及极低的免疫原性等的诸多优势，有望成为细胞治疗及组织工程更为理想的种子细胞。参考文献AlpCan，SepcinKarahuseyinoglu.Concisereview：Humanumbilicalcordstromawithregardtothesourceoffetus❷❷derivedstemcells〔J〕.StemCells，2007;25:2886❷❷95.CampagnoliC，RobertsIA，KumarS，etal.Identificationofmesenchymalstem/progenitorcellsinhumanfirst❷❷trimesterfetalblood，liver，andbonemarrow〔J〕.Blood，2001;98:2396❷❷402.GuillotPV，GotherstromC，ChanJ，etal.Humanfirst❷❷trimesterfetalMSCexpresspluripotencymarkersandgrowfasterandhavelongertelomeresthanadultMSC〔J〕.StemCells，2007;25:646❷❷54.PereiraWC，KhushnoomaI，MadkaikarM，etal.Reproduciblemethodologyfortheisolationofmesenchymalstemcellsfromhumanumbilicalcordanditspotentialforcardiomyocytegeneration〔J〕.JTissueEngRegenMed,2008;21(7):394❷❷9.JomuraS，UyMichellK，etal.PotentialtreatmentofcerebralglobalischemiawithOct❷❷4+umbilicalcordmatrixcells〔J〕.StemCells，2007;25:98❷❷106.WangHS,HungSC,PengST,etal.MesenchymalstemcellsintheWh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