p-地中海贫血三重突变杂合体的基因型分析
胡朝晖 刘元力 曾征宇 张晓璐朱庆义
·I临床遗传学论著·
【摘要】 目的对1例罕见的p地中海贫血三重基因突变杂合子进行基因型分析。方法采用反向
点杂交和DNA测序法分析患者p珠蛋白基因型。结果反向点杂交结果显示,此病例p珠蛋白基因上有
转录子+40~+43、密码子41/42、IVS-2.6543种突变。基因克隆以及DNA测序分析证实患者一条染色体
上存在+40一+43(.AAAC)+c041/42(.咖)复合突变;其同源染色体上存在IVS-2—654(c—T)点突变。患
者基因型为[+40一十43(-AAAC)·c041/42(.1娜)]/IVS-2.654(C—T)。结论p地中海贫血[+40一+43
(.AAAC)·C1)41/42(.1'c'Tr)/r、I]突变基因型是我国一种新的地中海贫血突变类型。
【关键词】p地中海贫血; 突变;基因克隆;测序
ptII;出图啪liamajorcausedbyeompoulldheterozygosityfor4-40to4-43(·AAAC),IVS-.2-654(CtoT)and
eodon41/42(-a'crr)HUZhao-hu/,LIUYuan-li,ZENGZher蟹-yu,ZHANC,Xiao-lu,ZHUqing-yi.
(c枷ng=houKingmMC砒erforClinicalI.a,boratory,Q坷,鹌洳u,C,uangdong,510330P.R.Ch/na.Erna//:zhao—
huitm@yahoo.tOm)
【Abstract】ObjectiveToreporttheanalysisofarareptha】as鳅11iaternaryheterozygote[+40tO+43(.
AAAC)‘cD41/42(一11饥’)‘IVS-2-654]causingpt}la】asseIniamajorinaChinese.MethodsUsingPCIt-ASOprobe
hybridizationanalysisto8calrl17knowntypesofbeta-thalassemiamutations,andgenecloningandDNAsequencingtoi-
dentifytheunderlyingcausativemutation.ResultsReversedotblot(RDB)analysisshowedthatthepatient’st3-globin
genehadthreemutationsto:+40tO4-43(-』恤~C),c041/42(一唧)andIVS-2—654(CtOT).p-globi.genecloning
andsequencingprovedthat,thetwodeletionsof+40to+43(一从AC)andCD41/42(一咖)co-existedOnthes03ne
chronllosome,andtheotherhomologouschromosomehadallIVS-2-654(CtoT)mutation.Sother.tuentisacompound
heterozygoteof[+40tO+43(一舢诅c)·CD41/42(-咖)]/IVS-2—654(CtOT)leadingtot3-th,aassemlamajor.Con-
dusion13aetriplemutationof[+40tO+43(一AAAC)·CD41/42(-l'crr)/rIi]isarlewgenotypeofbeta-thalassemia
inChinese.
【KeyWOrdS】p血llas锹llia;mutation;genedone;l瑚lllellCe
p地中海贫血(简称p地贫),是一种常见的血液遗传病,由
于p珠蛋白基因突变导致p珠蛋白合成受抑制而引起的溶血
性贫血。由于世界范围内的移民不断发生,地中海贫血实际上
已分布在世界范围,目前全世界已发现的阻珠蛋白基因突变有
200多种,包括碱基置换,小的碱基缺失等,中国也发现有30多
种基因突变⋯,这些突变可造成p珠蛋白基因合成产物降低(B
+地贫)或不能合成(酽地贫)而引起p地中海贫血。该病为常
染色体隐性遗传,且有高度异质性,p地贫纯合子患者需定期输
血维持生命,但是p地中海贫血的严重程度可由于合并弘地中
海贫血而有明显改善,p地贫纯合子复合∞地中海贫血时其可
不依赖输血。
我们采用聚合酶链反应(polyma艘chainreation,PCR)和反
向点杂交技术,对1例p地中海贫血患儿血样进行
,发现
基因型为[+40,+43(.AAAC)·cD41/42(.rI℃.I,I')]/IVS-2—654(C
—T)的特殊病例,报告如下。
1对象与方法
Ll对象患儿,女,广东海丰县澎湃纪念医院儿科临床诊断
作者单位.510330广州金域医学检验中心
为重型8地中海贫血,采取患儿静脉血2mL,EDTA抗凝。由于
患儿死亡,无法联系到家属未采取到家系其他成员血样。
1.2试剂和仪器DNA提取试剂盒(上海申能博彩),LA砌
酶(El本TaKaRa公司产),凝胶回收试剂盒(OMEC月,),廿地贫基
因诊断PCR试剂盒(深圳亚能),p地贫基因诊断反向斑点杂交
试剂盒(深圳益生堂生物企业有限公司),r,CEM—T载体(Prom.
单),PCR引物由上海英骏生物技术公司合成,基因扩增仪FI'C.
200型(MJResearch)。
1.3地贫基因突变检测提取患儿基因组DNA,n地贫基因诊
断采用四重PCR,同时检测中国人常见的3种缺失突变(.p”,
.一。2和.SEA);13-地贫采用反向点杂交法检测基因突变型,p地贫
基因诊断采用PCR结合反向点杂交技术,检测中国人群8个常
见突变位点[TATAbox-29,TATAbox-28,CDl7,CD41-42,CD43。
CD26(HbE),CD71/72,IVS2nt654]和9个“稀少”突变位点
(TATAbox-32,TATAbox-30,Cap+40一+43,IVSInt,CDl4-15,
CD27/28,IVSl-1,IVSl-5,CD31)。经变性、杂交、显色后出现蓝
色斑点为阳性,具体操作方法见试剂盒说明书。
1.4 B珠蛋白基因全序列扩增 根据CenBank基因库核苷酸
序列(基因号:NⅣ925006.1),用Primerpremier5.0软件设计包
含转录启动子.100序列以及3个外显子在内的B珠蛋白基因序
万方数据
列,上游5’.AGAAACCATCTCGCCGTAAA-3’(865272—865291);下
游5'-AGTGCCAGAAGAGCCAAC,GA-3’(867429—867448)。勾’增
用TaKalhLA死g酶。I:'CR反应体系总容积50止,每一反应体
系中含10×LA扩增缓冲液5皿,上下游引物各200nn帕l/L、250
nm/LdNTP$,模板DNA约200ng,2.5UTaKaRaLA‰酶。反
应条件为940c1min,65℃2rain,35个循环,最后72℃10rain。
1.5 PER扩增扩增产物用凝胶回收试剂盒回收目的片段一
纯化一连接到珊T载体,操作方法按试剂盒说明书。然后
参照分子克隆实验手册[2】,将连接产物转化进E.doiDH5a中,
37℃培养过夜。
1.6阳性克隆筛选鉴定挑取多个培养的单克隆,接种于含
50∥mLAmpLB培养液中,37℃震荡培养过夜。用v-gene质粒
快速提取试剂提取质粒DNA。以提取的质粒DNA为模板,用
前面的p珠蛋白全基因组引物PCR扩增筛选阳性克隆。
1.7地贫基因型分析将反向斑点杂交检出的阳性者克隆,
用p地贫反向点杂交试剂盒检测,分析该患者地贫基因型,随
后将杂交结果送上海英骏公司进行测序验证,序列比对采用
DNAMAN软件分析。
2结果
·419·
2.1母,p地贫检测结果用四重PCR扩增法检测患儿a珠蛋
白基因,未检出.|~,.a4。2以及一SEA基因突变。p地贫基因诊断
发现患儿B珠蛋白基因扩增产物可与CD41/42和IVS-2.654正
常和突变探针杂交,以及与CAP突变位点杂交。表明该患儿同
时存在CD41/42,IVS-2-654以及CAP3突变位点。
2.2口珠蛋白基因克隆杂交结果挑取6个阳性克隆,用反向
点杂交方法分析。筛选的阳性克隆中检出eapsite+cD41/42(.
TCITI')突变型和IVS-2-654(pT)突变型两种基因型。
2.3基因测序结果eapaite+cD4l/42(.,I℃1’11)阳性克隆中检
出+40~43(.AAAC)复合密码子41/42(.7啊r)突变,IVS-2.654
(C—T)阳性克隆检出ⅣS-2.654(pT)突变(图1),基因测序证
实患儿基因型为[+40—43(.AAAC)·CD4l/42(.TClT)]/Ⅳs-2.
654(C-*T)。
啪∞ft∞∞^1^^^^‘tc^c∞f^c^‘c“tcT^竹a州“^竹T∞"Ct0●【^c^^CtCT洲●n^∞^●0讨c■ACPCCAlGG'TGCAC:cTGAL'T(crG瞄雎^翦'c,雠靠l盯0优mT翻蔷蚴鲥“^CCT∞●t“^CTTC订I
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图l患儿+40一43(一AAAC)复合CD41/42(一TcrI.)突变测序图箭头示突变
3讨论
p地贫是广东省最常见的遗传性血液病之一,密码子41/
42和IVS-2-654是中国人较常见突变⋯1,转录区+40一+43(.
AaAC)突变,最早在中国人群中发现【3]3,但该突变携带率较低,
在中国人群中发现很少,容永忠等【4J对广州市区3662例产前
检查人群调查以及谭金荣等【5]对广东四会2531例成人和新生
儿调查均未检出该种突变,此突变为中国人群中罕见突变。本
篇报道的病例其p珠蛋白基因克隆和杂交结果以及测序结果
显示,密码子41/42以及cap+40一+43两个突变位点发生在
同一条染色体上,而在同源染色体上则存在IVS-2-654突变。
其中+40一+43(.Axac)和CD41/42(.唧r)组成的等位基因型
为首次报道并已在GenBank注册(GenBankaccessionNo.
EI溯9),首次证实中国人群中存在[+40一+43(-AAAC)·
cD41/42(.Tcrr)/N]地贫基因型。但由于无法联系到患者家
属,未能进一步进行家系分析。
患儿为同时携带3种地贫突变型的p地贫纯合子,其中
CD41/42(..I℃T1r)是一种移码突变,可导致合成无功能肽链,造
成p地中海贫血【63;+40一+43(.AAAC)突变是p珠蛋白基因
5’非翻译区缺失突变,可导致口+地中海贫血【7,81;IVS-2-654(C-"
T)为由于该位点出现的碱基置换形成了一个新的裂解信号,影
响正常位点的剪接,产生异常mRNA,导致p+地贫【9]。一条染
色体上同时出现两个突变,在国内外发现的较少,具体发生机
制并不清楚,推测可能与基因发生的频率高低有关,李厚钧
等[10]在甘肃地区发现的[.28(A---G)·CDl7(A-+T)/N]基因型,
这两种基因型在当地的检出率高达28.2%和14.0%,本病例的
基因型CIMl/42(一TCIT)在广东地区的突变频率也高达
41.9%[1】1。根据国内外对此类突变类型的家系分析发现,一条
染色体上出现双重突变杂合子,另一条染色体正常时,此种突
变导致的结果仅相当于一个点突变,患者仅表现轻度贫血症
状,相当于单一的点突变杂合子【11,圳,但是当两条染色体上出
现三重突变时,可能会造成严重后果,Fedorov等Ⅲ』曾报道过l
例Ⅳs-I-l(G—C)纯合子复合-42(C-"G)导致重型p地中海贫血
的病例,Heath等【13]也报道了1例[Nt494+129T---C·NT494+
132C----A](沉默突变)复合Ntl58C-,-T(F))突变结果导致中间型
地贫的家系分析报道。
万方数据
·420· 主堡匿堂遣堡兰鲞查垫堡笙!旦箜垄鲞箜!塑墅!』型鲤:地垫堕:型:垄:坠:皇
患儿两条染色体上的p基因均存在致病突变,可导致p珠
蛋白链合成严重不足,这也可能是导致临床表现为重型地中海
贫血的原因。根据目前报道的类似病例的家系分析发现,这些
复合突变型均为在家系类遗传突变,并且符合孟德尔遗传规
律,推测患儿父母可能有一方基因型为[+40一+43(一AAAC)·
CD41/42(一7I_cIT)/N]。值得注意的是,此3种突变在目前实验
室通过基因筛查皆可发现,因此加强地中海贫血产前诊断,对
防止或减少地贫儿出生是很有必要的。
参考文献
l IJ0llgGF,融删.eds.Hemoglobin&Hemoglobinopathies.1sted.
C“l/lgxi:SciencePress,2003.225-229,233-235.[龙桂芳,张俊武.血
红蛋白与血红蛋白病.第1版.广西:广西科学技术出版社,2003.
225.229,233-235.]
2 Sambro&J,FritschEF,ManiatiaT.Molecularcloning:alabora姗IIl∞.
ual.2nded.Beqing:SciencePress,1996.49-55.[J.萨姆布鲁克,E.
F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验
.第2版.北京:科
学出版社,1996.移55.]
3 HuangSz,XuYH,zer唔FY,砑d.Anovdbeta-thalassanmianmtatlon:
deletiond4bp(-AAAC)inthe5’han卵ripti砌aequefice.廓_,Haema.
to/,1991,78:125.126.
4 RmgYZ,LiB,Lai蕊,eg口1.Stuay0fprenatalscreeningandgonediag-
∞出oftllalas卿nia.蕊nJB/rthHealthHered,2006,14:7-9.[容永忠,
李斌,赖兆新,等.地中海贫血产前筛查及基因诊断研究.中国优生
与遗传杂志,2006,14:7-9.]
5 TanJR,LiWJ'IdaJY,ddf.Molecularepidemidogicalstudyofa-and
p岫lasⅫ血in$ihmdry..,胁MilMedUniv,2003,23:716-719.[谭
金荣,李文军,马建英,等.四会市a和B-地中海贫血的分子流行病
学调查.第一军医大学学报,2003,23:716-719.]
6
7
9
11
L∞∞nlbalV,WongehanehailertM,SattayasevanaB,甜a/.Clinicaland
hematologicfeamres0f酽.thalassemia(frameshift41/42mutation)inThai
pati删【18.Haematdog/m,2001,86:138—141.
TtmnenS,SehechterAN.Genl'tt五cdiseaseofhemoblobin:diagnosticmeth—
odsforducidatingptIlal∞∞池mutations.B/oodRev,2001,151:19—29.
sIp咖A,R矾ltledgeS,AnteniouM, 露a/.Thala.q嘲elniamutations
withinthe5’UTR0fthehumanbe协globiIlgenedisrupttranscription.BrJ
Haematd。2004,124:828.835.
HuangSZ,ZengFY,RenZR,日耐.RNA廿anscriptsofthebeta-thalas-
saemfiaalleleIVS-2-654卜T:asmalla“JOtllat0fnormally口wcessedbccta-
蛐mRNAis撕Uproduced蛔lthewaltantgene.BrJHaemaw/,
1994.88:54l-546.
“HJ,刁l伽CW,YuWZ,群a/.Geneidentificationandpedi孵analysis
0fthedoublemutationheterozygoteofbeta-thal蒯a[一28(A÷G)·CI)17
(A,T)/N].踟lJMed白耐,1996,13:5.7.[李厚钧,周常文,余伍
忠,等.一种新的p地中海贫血双重突变杂合体[.28(A---G)·CDl7
(A—T)/N].中华医学遗传学杂志,1996,13:5.7.]
FedorovAN,NasyrovaF,SmirnovaEA,eta/.IVS-I.1(G.+C)inoⅢ曲.
nationwith42(c.+G)iIlthepromoterregion0fthebeta-globingenein
patientsfrom喇ikiaan.Hemoglobin,1993,17:275—278.
YangZQ,Chu“,SiftL,da/.Beta-globingenevariati·mina鼬ly
with∞vembetathalassen】ia.ChinJBirthHedthHered,2002.10:21.23.
[杨昭庆,褚嘉丰占,史磊,等.一个重型p地中海贫血家系中的口珠
蛋白基因变异.中国优生与遗传杂志,2002,10:21.23.]
HeathJA,BeaverⅫK,GiardinaP,et耐.Anardbeta-蛐inter-
mediap1日哪containingNt494+129T--"CandNT494+132C--’AHRl一
rationsincisandaNtl68C--。T(be!ta(O)39point)mutationintrans.Am
JHemato/,2001,67:57-58.
(收稿日期;2007.12-11)
(本文编辑刘萍)
罕见的t(3;14)(q29;q11)一例
周敏马金元徐樨巍宋文琪
患儿女,2岁。因说话不清,走路不稳就诊。患儿系第l
胎,足月顺产,生后无窒息,出生身长56em,体重3550g。8个
月会坐,I岁会独站,I岁半学走步。出生时父亲年龄26岁,母
亲年龄24岁。父母非近亲婚配,表型正常。
查体:3岁半时身高为103cm,体重17k。头偏大,眼距
宽,鼻梁低,双耳廓大,双耳位偏低(图1),腭弓高,心肺无异常。
细胞遗传学检查:外周血淋巴细胞培养,常规制片,G显
带。染色体核型为45,XX,t(3;14)(3衄一3q29::14p11—
14q^er),见图2。
讨论据文献报道的t(3;14)病例少见,且染色体的断裂
点均与本例不同。染色体畸变所引起的I临床效应多种多样,尤
以生长发育迟缓,智力低下多见,并常伴有五官、四肢、内脏等
多发畸形。本例患儿具有语言表达障碍,还伴有眼耳鼻的异常,
作者单位:100045北京儿童医院遗传室
临床细胞遗传学·
图1患儿面部图 图2患儿染色体核型图 箭头示异常染色体
据此,患儿的临床表现与染色体异常的相关性很大。
(收稿日期:2{X豫-Ol一14)
(本文编辑刘萍)
万方数据