动物实验设计

实验设计大纲 实验名称：复方丹参注射液合黄芪注射液治疗急性心肌梗死 课来源：自 选 设计班级：2008级临床本科8班 设计人员：毛元新 设计日期：2011年4月1日 指导老师：杨 拯 成都医学院实验技术教研室 2011年制 一、实验设计的目的意义：实验设计的目的意义，国内外研究现状，存在的问题，解决问题的思路。 目的与意义: 复制急性心肌梗死动物模型，比较复方丹参注射液合黄芪注射液和临床常规治疗药物的疗效，从而探讨复方丹参注射液合黄芪注射液是否对急性心肌梗死有较好的临床效果，为临床上治疗急性心肌梗死提供一种中西医结合的新思路，具有十分重要的意义。 国内外研究现状：急性心肌梗死(AMI)是由冠状动脉供血不足所引起的心肌坏死的临床综合征，AMI发病突然、凶险、病死率高，抢救治疗必须争分夺秒。急性心肌梗死常导致冠心病患者心律失常及心脏骤停，严重可导致患者猝死[1]。患者由于冠状动脉病变，动脉内粥样斑块破裂，使冠状动脉供血不足而导致心肌急性坏死。其治疗原则是尽快抢救恢复心肌的血液灌注和及时、充分开通闭塞的血管，以挽救存活及濒死心肌[2]；防止梗死扩大或缩小心肌缺血范围，限制和缩小梗死面积可以最大限度地减少心脏泵功能衰竭或与其相关的致命性心律失常以及心脏破裂的发生，保护和维持心脏功能；及时处理并发症[3]；是急性心肌梗死治疗的重要目标之一。而治疗时如何使急性闭塞的梗死相关血管尽早恢复前向血流，实现早期再灌注(早期血运重建)是达到上述目标的关键。近年来，对AMI的治疗进展较快，而且对改善AMI的预后起到了积极重要的作用，取得了很好的效果，AMI的治疗包括溶栓治疗、经皮冠状动脉介入(PCI)、冠状动脉搭桥术(CABG)、心肌干细胞移植等。[4] （1）溶栓药物的基本原理是通过影响凝血过程的不同环节，用外源性纤维蛋白溶解酶原激活剂，使纤溶酶原转变为具有活性的纤溶酶，它有很强的溶解纤维蛋白和纤维蛋白原的作用，并对抗纤溶酶抑制物有抑制作用，产生血浆纤溶激活状态，使血栓溶解。[5]近30年来溶栓疗法是AMI治疗的最大进展和关键治疗，使得AMI早期病死率大幅度下降，生存率不断提高。（2）1977年Gruenlzig经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)，开创了介入心脏病学的新纪元。尽管在AMI的溶栓治疗疗效显著，随着医疗条件改善，PCI治疗已广泛应用于AMI患者。 （3）冠状动脉搭桥术(CABG) 是目前公认的治疗冠心病、心肌缺血的有效方法，能有效缓解或改善心绞痛症状，改善心肌缺血，避免心肌梗死发生，提高生活质量，延长生命。[6]急诊冠状动脉搭桥术是挽救生命、缓解症状和提高生活质量的有效手段。 (4) 干细胞移植:近年来研究者们通过对心肌干细胞来源、移植途径、移植的剂量及时机和面临细胞存活、心律失常、心肌钙化等问题的研究明，干细胞移植可以增加有功能的心肌细胞的数目、稳定病损心脏结果、防止心肌重塑、避免导致充血性心衰，改善心肌的收缩功能，有望成为治疗AMI的最佳方法。 黄芪性味甘、微温,归脾、肺经,为补气要药。黄芪注射液是将黄芪中的有效成分[黄芪甲苷(C41H68O14)]提取制成的注射用中药针剂，具有益气养元，扶正祛邪，养心通脉，健脾利湿之功效。黄芪注射液中的有效成分黄芪甲苷具有较强的正性肌力作用,有保护心肌、减轻心肌缺血功能，其机制是通过抑制磷酸二酯酶的活性而发挥作用。[7]此外，黄芪注射液还具有免疫调节及抗菌作用和干扰病毒复制的功能。黄芪注射液以中药的功效有补气、开阳、固表止汗、利水消肿、生精止渴、补脾益肺作用。西医用之可使心肌收缩力加强，故有强心作用，并能通过改善心肌营养代谢而使心肌功能改善，慢性心衰病人久病气虚，正气下降，气虚血行不畅，故可用之。 丹参始载于《神农本草经》,色赤,味苦,微寒,归心肝经,活血化瘀,通心脉。复方丹参注射液由丹参、降香水溶性提取物制成，有效成分为丹参酮、原儿茶酮、原儿茶酸等，具有活血化瘀，理气开窍的功效。丹参对心、肝、肺、脑等多种组织器官的缺血再灌注损伤具有明显的改善作用;能保护线粒体,改善能量代谢;具有抗菌消炎及抗肿瘤作用。[8] 根据中医“气为血之帅，血为气之母”，“气行则血行，气滞则血瘀”的气血相关理论，以及“治病求于本”、“标本兼治”的治疗原则，将黄芪、丹参注射液联合应用，对急性心肌梗死具有很好的治疗作用；复方丹参注射液与黄芪注射液联合使用即可相互补充，有可增强共同作用，增强治疗作用。目前，临床对急性心肌梗死采用了许多不同的药物、仪器及手术治疗，但大部分费用比较昂贵，虽然黄芪和丹参注射液还未广泛用于急性心肌梗死的临床治疗，可是它在治疗治疗急性心肌梗死方面确实有作用，并且它价格低廉，因此，复方丹参注射液合黄芪注射液可能成为治急性心肌梗死的一种新药。本实验采用黄芪注射液合复方丹参注射液治疗急性心肌梗死，希望最终能提供一种较为理想的临床治疗方法。 存在的问题：目前临床上复方丹参注射液的使用很多，主要用于治疗脑血管意外、慢性肝炎、流行性出血热和肾功能衰竭等疾病。复方丹参注射液目前只局限在其他疾病的治疗，在临床上与黄芪注射液合用来治疗急性心肌梗死也只处于试验阶段，在临床上还未被定为常规治疗用药。 解决问题的思路：复制急性心肌梗死的动物模型。对急性心肌梗死动物分别给予复方丹参注射液+黄芪注射液、复方丹参注射液、黄芪注射液、阿托普利，并作空白对照和实验对照。 参考文献： [1]项建立．急性心肌梗死的治疗进展[J]．医学理论与实践，2009，22 (8)：907—9l1． [2]贾浩．急性心肌梗死不同时期溶栓的疗效观察和分析[J]．临床医学，2006，26(10)：66—67． [3] 叶任高，陆再英．内科学．人民卫生出版社，2006：283-297． [4] 中华医学会心血管病学分会．急性心肌梗死诊断和治疗指南．中华心血管病杂志，2001，29：713-714． [5]都志敏，马静，黄贤胜．溶栓药物在急性心肌梗死治疗的应用进展[J]．承德医学院学报，2009，26(1)：76—77． [6] 苏丕雄，肖峰，张勇，等．急诊冠状动脉搭桥术．中华心外科杂志，21303，17(5)：277-279． [7] 王莉，赵长云，赵国瑞，等．复方丹参注射液加黄芪注射液治疗冠心病58例疗效观察[J]．中国中医药科技，2002，9(4)：252． [8] 于红，赢书宝，刘光伟，等．黄芪注射液与复方丹参注射液配伍治疗缺血性心脏病100例临床分析[J]．中药药理与临床，2001，17(3)：36． [9] 杨建业，安庆宝，张迎春，等. 液氮冷冻大鼠左冠状动脉前降支中上1/3所支配区域建立心肌梗死模型 [J]. 中国比较医学杂志, 2008, 18(3):51-54. [10]王莉 赵长云 等.复方丹参注射液加黄芪注射液治疗冠心病58例疗效观察[J].中国中医药科技,2002,9:252. [11] 于红,赢书宝,刘光伟,等.黄芪注射液与复方丹参注射液配伍治疗缺血性心脏病100例临床分析[J].中药药理与临床,2001,17(3):36. [12]Gajos G.Optimal treatment for patients after myocardial infarction:some current concepts and controversies.Pol Arch Med Wewn，2008，118(1-2):43-51. 二、实验设计（实验设计目标,拟解决的主要问题, 实验动物设计,实验专业设计，实验统计设计,实验方法设计，可行性分析,预期结果，实验设计工作时间安排）。 （一）实验设计目标，拟解决的关键问题 设计目标：探讨复方丹参注射液+黄芪注射液和单独使用复方丹参注射液、黄芪注射液、阿托普利对实验性急性心肌梗死治疗疗效上的不同，从而探讨复方丹参注射液合黄芪注射液能否作为一种新型的较为理想的临床治疗方法。 拟解决的关键问题：sD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，经口人工呼吸，开胸结扎左冠状动脉前降支，制备动物试验性急性心肌梗死模型。对试验性急性心肌梗死模型进行分组与实验结果分析。 （二）实验设计 1、实验动物设计 实验动物的描述：健康雄性SD大鼠100只，SPF级，4～6周龄，体重17～l8g。 实验动物遗传背景：此动物为近交系动物，近交代数为10，品系数为12。 实验动物的微生物背景：要求对毛滴虫，鞭毛虫，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，乙型溶血性链球菌，绿脓杆菌，小鼠肺炎病毒，小鼠脑脊髓炎病毒，做国家标准性检测。 我们选用200—250g左右的雄性SD大鼠作为实验动物，有以下几点理由： (1）、SD大鼠易得到，价格适中且容易饲养，在科研中已被广泛利用。 (2）、 SD大鼠的冠状动脉左前支易找到，使得冠状动脉结扎术的难度减小，且术后存活率高身体机能恢复较快。 2、实验专业设计 选用雄性SD大鼠作为实验动物，分别给予复方丹参注射液+黄芪注射液、复方丹参注射液、黄芪注射液、阿托普利，观察对实验性急性心肌梗死治疗作用。观察心电图、心肌组织HE染色、梗死面积、梗死区室壁厚度变化、心室肌质量／体重、颈总动脉收缩压(SBP)和舒张压(DBP)，向前推送导管至左心室测量左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)等参数。[9] 3、实验统计设计 （1）随机：先将试验大鼠称重，然后先按体重每10g为一个重量级，从小到大排列为若干个组，随后用龙胆紫和苦味酸将大鼠进行标记，龙胆紫表示个位，苦味酸表示十位，从大鼠的左爪开始标记，记为1，随后依次将左侧腹部，左后爪，右前爪，右侧腹部，右后爪，颈部，背部，尾部记为2，3，4，5，6，7，8，9。随后得到大鼠1至80的编号，再在随机数表中查询数字并分组。 （2）对照：本组实验做了空白对照和实验对照，在前面的专业设计里已经提及。 （3）重复：本实验采用的是每实验小组有20只SD大鼠，具有一定的重复性。 （4）统计数据收集：本实验搜集计量资料，初步确定对各组实验数据的比较分为实验值和基础值比较。 表1心电图记录表 组别 1d 1w 2w 3w 4w 复方丹参注射液+黄芪注射液           复方丹参注射液           黄芪注射液           阿托普利           造模组                       表2心肌组织HE染色试验记录表（ ±s） 组别 1d 1w 2w 3w 4w 复方丹参注射液+黄芪注射液           复方丹参注射液           黄芪注射液           阿托普利           造模组                       表3梗死面积大小记录表（ ±s） 组别 1d 1w 2w 3w 4w 复方丹参注射液+黄芪注射液           复方丹参注射液           黄芪注射液           阿托普利           造模组                       表4梗死区室壁厚度变化记录表（ ±s） 组别 1d 1w 2w 3w 4w 复方丹参注射液+黄芪注射液           复方丹参注射液           黄芪注射液           阿托普利           造模组                       表5心室肌质量／体重记录表（ ±s） 组别 1d 1w 2w 3w 4w 复方丹参注射液+黄芪注射液           复方丹参注射液           黄芪注射液           阿托普利           造模组                       表6颈总动脉收缩压(SBP)和舒张压(DBP)记录表（ ±s） 组别 1d 1w 2w 3w 4w 复方丹参注射液+黄芪注射液           复方丹参注射液           黄芪注射液           阿托普利           造模组                       表7左室收缩压(LVSP)和左室舒张末压(LVEDP)记录表（ ±s） 组别 1d 1w 2w 3w 4w 复方丹参注射液+黄芪注射液           复方丹参注射液           黄芪注射液           阿托普利           造模组                       表8左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)记录表 组别 1d 1w 2w 3w 4w 复方丹参注射液+黄芪注射液           复方丹参注射液           黄芪注射液           阿托普利           造模组                       (5）统计数据分析 本实验采用计量资料来测定各种指标的数值，除了心电图外所有数据均采用平均数±标准差( ±s)表示，七组间实验数据比较行完全随机单因素方差分析，复方丹参注射液+黄芪注射液、复方丹参注射液、黄芪注射液、阿托普利、造模组间行两样本比较t检验，均以0.05作为显著性检验水准。 4、实验方法设计 实验技术路线 SD大鼠 实验技术方法 (1) 随机抽样：选正常成年健康重量相近的SD大鼠100只，从造模成功的大鼠中选出 80只大鼠按体重由小变大编号后，从随机数字表中查取随机数字，依次抄录于SD大鼠编号。 (2) 实验编号与分组：先将试验大鼠称重，然后先按体重每10g为一个重量级， 从小到大排列为若干个组，随后用龙胆紫和苦味酸将大鼠进行标记，龙胆紫表示个位，苦味酸表示十位，从大鼠的左爪开始标记，记为1，随后依次将左侧腹部，左后爪，右前爪，右侧腹部，右后爪，颈部，背部，尾部记为2，3，4，5，6，7，8，9。随后得到大鼠1至80的编号，再在随机数表中查询数字并分组。 (3) 实验手术：抓取手术大鼠，观察其是否健康，如果老鼠身体状况有异，应要更换老鼠。然后在电子称上称其重量，并做好记录，根据体重严格计算麻醉剂量，采用胸部注射麻药。大约三分钟左右，大鼠出现站立不稳，醉酒样步态。四肢固定与手术台上，松紧适中，手术过程中注意观察四肢是否出现瘀血，注意按摩。此时，可用大头针刺激大鼠尾巴，如果大鼠的反应不强烈，预示着可以开始手术。首先剪除大鼠前胸区域毛，而后均匀喷洒碘伏溶液于备皮区域。开通人工呼吸，BL一410生物机能实验系统行心电监测，从左胸纵切口分层开胸。 (4) 模型复制： 于胸骨左缘第4肋间用血管弯钳稍用力穿透肋间肌进入胸腔，并迅速沿肋间隙方向撑开血管钳而钝性分离肋间肌;术者用另一血管弯钳垂直肋间隙撑开肋骨，暴露心脏。在肺动脉圆锥和左心耳之间，距左冠状动脉起始2mm处穿5—0号无创伤丝线，结扎该段冠状动脉。结扎后可见左室前壁失去原有光泽，变苍白，并出现搏动减弱，心电监测可见肢体导联R波振幅明显升高，随后出现I、aVL导联ST段明显抬高，证实制作AMI模型成功。术后注射青霉素预防感染。 (5) 处理措施： ①复方丹参注射液+黄芪注射液：建模成功后即刻注射复方丹参注射液1ml/100g，黄芪注射液1ml/100g。以后每隔24h按上述剂量注射一次。[10] ②复方丹参注射液：建模成功后即刻注射复方丹参注射液1ml/100g, 以后每隔24h按上述剂量注射一次. ③黄芪注射液：建模成功后即刻注射黄芪注射液1ml/100g。以后每隔24h按上述剂量注射一次。 ④阿托普利: 建模成功后即刻给予正常治疗剂量的阿托普利，以后每隔24小时给予上述剂量的阿托普利。 损伤组：建模成功后不给予任何治疗措施。 (6) 取材：将压力传感器与BL-410生物信号采集系统连接，测量并记录所需要的各项指标。经股静脉注入10%KCl 2 ml，使心脏停搏于舒张期，迅速取出心脏，用PBS液洗去血液，滤纸吸净水分后用电子天平(精确到0.1 mg)分别称取左、右心室实际重量(LVAW、RVAW)，计算其与体质量(BW)的比值，得到左、右心室相对重量(LVRW、RVRW)。将心脏从心尖到心底沿长轴横切4等分，用4%多聚甲醛固定24 h后分别石蜡包埋。各取一张5 μm的病理切片作HE染色。[11]用HPIAS彩色病理图文分析系统测量每张切片的心内膜缘总长及心梗部位心内膜缘长度，计算梗死面积。 (7) 指标检测： ①心电图：于术后0h、24h、1w、2w、3w、4w，分别观察其心电图的变化。 ②HE染色切片观察：在24h、1w、2w、3w、4w，时分别从5组中每组随机取出4只大鼠处死，并迅速取出心脏，PBS液洗去血液。用甲4%多聚甲醛固定24 h后分别石蜡包埋。各取一张5 μm的病理切片作HE染色并观察。 ③血流动力学检查（SBP、DBP、LVSP、LVEDP、左室内压最大上升和下降速率) 在24h、1w、2w、3w、4w，时分别从5组中每组随机取出4只大鼠，用3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，气管切开插管，保持呼吸道通畅。分离右侧颈总动脉，插入2F聚乙烯导管，0.3%肝素生理盐水抗凝，将压力传感器与BL-410生物信号采集与处理系统连接，测量并记录颈总动脉收缩压(SBP)和舒张压(DBP)，向前推送导管至左心室测量左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)等参数。 测定SBP、DBP、LVSP、LVEDP、左室内压最大上升和下降速率的意义：这些指标能直接反应出心脏的恢复情况，从而了解到各种处理措施对大鼠恢复心脏功能的作用。 梗死面积大小、梗死区室壁厚度变化、心室肌质量／体重指标的测定：在24h、1w、2w、3w、4w，时分别从5组中每组随机取出4只大鼠，处死大鼠后用滤纸洗净，用电子天平分别称取左、右心室实际重量(LVAW、RVAW)，计算其与体质量(BW)的比值，得到左、右心室相对重量(LVRW、RVRW)。将心脏从心尖到心底沿长轴横切4等分，用尺子测量心室的厚度，并用4%多聚甲醛固定24 h后分别石蜡包埋。用HPIAS彩色病理图文分析系统测量每张切片的心内膜缘总长及心梗部位心内膜缘长度，计算梗死面积。[12] 从梗死面积的变化情况可以知道该处理措施是否减小了梗死面积，从梗死区室壁的厚度变化我们可以知道各种药物处理是否对心室壁的重构有影响，从心室肌质量/体重可以知道心肌代偿肥大的程度。 （三）可行性分析 1、SD大鼠易得到，容易饲养，在科研工作中被广泛利用。 2、手术器材、设备、仪器、药品均为实验室常用或易于得到。 3、实验药品较便宜，且选用大鼠使实验成本较低。 （四）预期效果 1、复方丹参注射液合黄芪注射液治疗急性心肌梗死疗效更明显。 2、为临床上进一步研究联合药物治疗急性心肌梗死提供可靠依据。 3、复方丹参注射液合黄芪注射液可以考虑作为临床上一种联合用药治疗急性心肌梗死。 （五）实验设计工作时间安排 1、共计2d完成分组及编号 2、共计7d完成模型复制 3、共计35d完成实验 三、完成实验的条件 1、仪器设备情况：本实验采用机能实验室常用手术器械、大鼠板、2F聚乙烯导管、注射器、电子秤、鼠笼、显微镜、高压灭菌锅、尺子、BL-410生物信号采集系统、HPIAS彩色病理图文分析系统等。 2、实验动物情况：健康SD大鼠100只。 3、药品试剂来源：戊巴比妥钠、75%消毒酒精、碘伏、生理盐水、0.3%肝素生理盐水、4%多聚甲醛、青霉素、复方丹参注射液、黄芪注射液、阿托普利、苏木精 — 伊红试剂、龙胆紫、苦味酸等。