荔枝果干蛋白质组成及其抗氧化性研究

荔枝果干蛋白质组成及其抗氧化性研究 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 荔枝果干蛋白质组成及其抗氧化性研究 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.8 唐道邦，卜智斌，徐玉娟，吴继军，温靖，余元善 (广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东省农产品加 工重点实验室，广东广州 510610) 摘要:分析荔枝干果肉蛋白组成并比较不同组份蛋白质的抗氧化 性。采用等电点法提取不同组份蛋白质，利用氨基酸自动分析仪测定 不同组份蛋白及总蛋白的氨基酸组成，用超高压液相质谱联用系统 Q1扫描测定不同等电点组份中小分子蛋白分子量分布，用抗氧化试 剂盒测定不同等电点组份蛋白质的抗氧化性。试验结果表明荔枝浆浸 泡2 hpH 3.5、pH 5.5、pH 6.5和pH 7.5为荔枝蛋白的4个等电点，且 4个等电点组份蛋白含量分别占果肉总蛋白的12.03%、9.45%;不同 组份蛋白氨基酸种类相同、含量不同;pI 3.5和pI 5.5组份中含量较 高的小分子蛋白集中在组份中含量较高的小分子蛋白主要集中在 1000 Da和5000 Da附近。说明不同组份荔枝蛋白抗氧化性不同。基 酸含量、分子量分布及抗氧化性不同。 关键词:荔枝;蛋白质;等电点;氨基酸;抗氧化性 文章篇号: 1673-9078(2013)8-1851-1856 TANG Abstract: compared. Different components of proteins were extracted with (pI) and amino acids of extracted proteins were MP) were —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ studied W) of the mian component of SMP at pI 3.5 and 5.5 were near 5000 Da, while MWW distribution and antioxidant activity. Key words: 荔枝()是无患子科荔枝属[1]，但中医理论讲究系统论，某研究已表明荔枝具有降血糖等药理作用[2]，并认为与 收稿日期:2013-04-23 基金项目:国家“十二五”科技支撑计划项目(2012BAD31B03);广东省科技计划项目(2011A08080311;2011A060903007;2012B040500058;2012B091000157) 作者简介:唐道邦(1973-)，男，副研究员，研究方向:农产品贮藏与加工 其所含有的蛋白质、氨基酸及皂苷等成分有一定的关系[3];蛋白质是果实营养的组成成分之一，参与果实 其他品质特征成分和风味物质的合成，与多糖等其他大分子物质结合影响荔枝的功效作用;氨基酸能参与美拉德反应，与氧化的酚类物质发生褐变反应，并直接影响产品的感官品质[4~5]。 目前对荔枝果肉的研究主要集中在果干果汁加工工艺及功能活性成分的提取、测定等方面，但关于果肉蛋白质、氨基酸组成及其抗氧化性能的研究尚未见详细的报道。蛋白质作为一类具有生物活性成分的重要营养成分影响物质的品质，荔枝干制由高水分含量降低至含水量25%以下的过程中荔枝果肉蛋白质与糖发生美拉德反应，实际上是一种复杂的蛋白糖基化过程[6]。蛋白糖基化改性能显著改善蛋白质—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 的溶解性、热稳定性、乳化性、凝胶性、粘度等各种性质，并能 1851 现代食品科技 [7] Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.8 增加某些蛋白质的抗氧化性、抗菌性、降低免疫活性。 本文旨在通过研究优化荔枝果干蛋白的提取方法，测定荔枝果肉中氨酸酸的种类、含量和不同组份荔枝果肉蛋白中小分子蛋白的分子量分布，并对果干蛋白不同组份的抗氧化性进行初步分析研究，为荔枝果干的品质评价、干制对荔枝功效作用的影响研究等提供一定的基础理论依据。 1.4 蛋白质和氨基酸测定方法 荔枝蛋白质测定:参考GB5009.5-2010《食品安全国家》中的《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法;氨基酸测定方法:参考GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》的方法 1.5 荔枝蛋白质组份抗氧化性测定 1 与方法 1.1 材料与试剂 荔枝果干(“怀枝”品种，测定果肉中蛋白质含量为2.45?0.21%，含水量为37.54?0.19%);氢氧化钠、浓硫酸、浓盐酸、重蒸苯酚、柠檬酸钠、冰乙酸、抗坏血酸，均为分析纯;消化剂(由FOSS福斯仪器公司配套)、高纯氮气、冷冻剂(冰块);总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒;羟自由基(?OH)测定试剂盒;抗超氧阴离子自由基(O2-?)—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 试剂盒均购于南京建成生物工程研究所;甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯(Merck公司) 1.6 精确称量各个毫克提取物加入1 30 min，取上清液进AB公司Turbo Ionspray源1.5理系统;资生堂公司液相色谱输液泵，资生堂公司泵)，对荔枝果干中的蛋白组份Q1 1.2 仪器设备 KjeltecTM8400Thermo scientific;PB-10型pH器(北京)有限公司;UV岛津;冷冻干燥器(、VOS-15B型HWS-24公司;AB公司Turbo Ionspray源及 1.7 数据处理和统计分析采用SPSS 14.0软件，结果?标准差(x?s)表示。 2 结果与分析 2.1 荔枝蛋白等电点测定 2.1.1 荔枝蛋白提取最佳时间测定 1.3 [8] 取200 g荔枝果干加入1200 mL蒸馏水浸泡8 h后用组织捣碎机破碎，胶体磨磨浆，取10等份每份 100 mL分别用1 mol/L的氢氧化钠和2 mol/L盐酸调至pH为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，静置30 min后以10000 r/min离心10 min，各取20 mL上清液，用凯氏定氮仪测定其蛋白质的含量，进行数据处理，测定荔枝粗蛋白质的等电点。 —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 1852 图1 不同浸泡时间对蛋白质提取量的影响 Fig.1 Effect of different immerse time on the extraction of lichi proteins 将荔枝浆调pH值至7.0后，分别放置0、2、4、6、8、10 h离 心测定上清液中蛋白质含量，分别测定 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.8 不同时间提取的蛋白质含量得出最佳浸泡时间。通过图1可以看 出，随着浸泡时间的增加，上清液蛋白质含量逐渐增加，浸泡2 h时 后蛋白与其他杂质分离效果最好，上清液中水溶性蛋白质含量最高， 但超过2 h后蛋白质含量略有降低且基本趋于稳定，因此在后续提取 蛋白时确定荔枝蛋白的最佳提取时间为2 h。 2.1.2 荔枝蛋白等电点测定 他及2g1853 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.8 白总含量的21.31%。 份提取蛋白样品质荷比主要分布在 580~670之间以及1040~1150之间，其它区间质荷比的丰度都很小， 含量很低;丰度较大的分子量集中在1000 Da和5000 Da附近。 2.2.2 荔枝果肉蛋白中小分子量蛋白分子量分布 —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 图4 pI3.5提取小分子蛋白的Q1扫描图 Fig.4 Q1 scanning diagram of SMP component at pI 3.5 图6 pI6.5 图5 pI5.5提取小分子蛋白的Q1 图7 pI7.5提取小分子蛋白的Q1 扫描图 Fig.7 Q1 scanning diagram of SMP component at pI 7.5 蛋白，[11]，据。图4、pI 6.5、pI 7.5组份Q1扫描图，从图4pI 在 1000以下和1200以上的丰量集中在Da附近。从图5中可以看出， pI 5.5提取蛋白扫描样品质荷比主要分布在1040~1150之间，质荷比 在1000以下和1200以上的丰度都很小，含量很低;在整个图谱中丰 度较大的分子量集中在5000 Da附近。从图6中可以看出，pI 6.5提 取蛋白扫描样品质荷比主要分布在520~580之间和1040~1150之间， 其它区间质荷比的丰度都很小，含量很低;丰度较大的分子量集中在 1000 Da和5000 Da附近。从图7中可以看出，pI7.5组 1854 2.3 荔枝蛋白不同等电点组份的抗氧化性比较 2.3.1 抗超氧 阴离子自由基能力测定 图8 不同等电点组份蛋白清除超氧阴离子自由基作用 Fig.8 The superoxide radical-scanvenging effect of the litchi proteins with different pI 超氧阴离子自由基(O2-?)不仅具有重要的生物功能，也与多种 疾病有密切的联系。它是基态氧接受1个电子后形成的第1个氧自由 基，可经过一系列反应生成其他氧自由基。因此，具有特别重要的意 —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 义[12]。 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.8 在反应体系中，1 g蛋白在37 ?反应40 min所抑制的超氧阴离子自由基相当于1 mg的维生素C所抑制的超氧阴离子的变化值为一个活力单位(U/gProtein)，数值越大说明其抗超氧阴离子自由基效果越好，从图8可以看出，四个等电点组份都具有清除超氧阴离子自由基的能力，由强到弱依次为:pI 3.5>pI 5.5> pI 6.5>pI 7.5。 2.3.2 清除羟自由基能力测定 图10 3 讨论 2小时即[14]，说明荔枝蛋白的提取与 助于揭示荔枝果干功能作用的物质基础。试验分析不pI 3.5组份蛋白具有最强的总抗氧化能力及清除超氧阴离子能力，pI 5.5与pI 6.5清除羟自由基能力最强，这可能由于不同组份蛋白的氨基酸组成以及分子量不同有关;同时由于荔枝蛋白的提取方法为“碱溶酸沉”法，在浸泡过程中可能存在色素、多酚多糖等具有活性作用的物质干扰，影响后续的蛋白质抗氧化分析，其不同蛋白组份的活性评价有待于通过动物试验或体外模拟试验进一步研究。 荔枝果干蛋白pI 3.5、pI 5.5、pI 6.5、pI 7.5四组等电点提取的蛋白用超高压液相质谱联用系统测定其中小分子蛋白，不同等电点组份小分子蛋白的组成不同，pI 3.5、pI 5.5组份含量较高的物质集中在—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 5000 Da附近，pI 6.5、pI 7.5组份含量较高的物质集中在1000 Da和5000 Da附近，表明四组等电点提取的小分子蛋白组成存在一定差异，且有可能是一类多肽类物质。试验还确证了不同组份蛋白的氨基酸含量不同，由不同的氨基酸组成和高含量的多糖推测荔枝干制过程中存在复杂的化学反应，试验的研究结果为从蛋白质组学角度深入研究荔枝功能变化提供一些理论基础。 1855 图9 不同等电点组份蛋白对羟自由基清除作用 Fig.9 Hydroxyl radical scavenging effect of litchi proteins with different pI 羟基自由基(?OH)被认为是毒性最强的活性氧自由基，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素[13]体系中规定每毫克蛋白在37 ?下反应体系中H2O2的浓度降低1 mmol/L基能力单位(U/mg Protein)。图9pI pH 6.53.5则与pI 的清除能力相当，且5.5能力明显大于pI 3.5与明显要弱于Vc 2.3.3 在位可知，四个等电点组份的pI 3.5组份蛋白具pI 5.5组份蛋白，而pI 7.5C的总抗氧化能力，pI 3.5、5.5、6.5组份蛋白的总抗氧化能力则显著高于维生素C，这可能是因为pI 3.5组份蛋白相比于其他组份含有较多的多肽片段，因此总抗氧化能力最强;而pI 7.5组份蛋白由于其小分子量物质过多，则可能大部分为游离氨基酸，并且这些氨基酸的抗氧化能力较弱，导致该组份蛋白的总抗氧化能力较—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 差。 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.8 4 结论 荔枝果干蛋白存在四个等电点，分别为pH 3.5、5.5、6.5、7.5; 四组等电点提取的蛋白氨基酸组成存在一定差异，并均具有一定抗氧 化性，其中含量较高的小分子蛋白主要集中在1000 Da和5000 Da附 近。 CAI Jin-xing, LIU Xiu-feng, ZHAO Xi-yan. Study on Extraction and Physicochemical Characteristics of Broad Bean Protein [J]. Science and Technology of Food Industry, 2007, 28(10): 142-144 [9] 张养军,王京兰,蔡耘,等.液相色谱-质谱联用方法用于严重 急性呼吸系统综合症冠状病毒结构蛋白质的研究[J].分析化 学,2004,32(4):415-420 ZHANG Yang-jun, WANG Jing-lan, CAI Yun, et al. Studies on Structural Proteins of Respiratory with Electrospray Tandem Mass Sof [10] 李小华,于新,毕阳.[J]. LI Analysis of contents of seeds [J]. Science ,.核糖体失活蛋白 [J]. 生物化学与生物物理学XIONG Chang-yun, ZHANG Zu-chuan. —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ Isolation, 参考文献 [1] Fan-Li Kong, Ming-Wei Zhang, Rui-Bin Kuang, et al. Antioxidant activities of different fractions of polysaccharide purified from pulp tissue of litchi (Litchi chinensis Sonn.) [J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 81(2): 612-616 [2] Bao Yang, Hengshan Wang, Nagendra Prasad，et al. Use of Litchi (Litchi sinensis Sonn.) Seeds in Health [M]. Nuts and Seeds in Health and Disease Prevention: Chapter 82, Salt Lake City: Academic Press 2011 [3] 王燕,王惠聪,周志昆,等.荔枝的功能及活性成分研究现状 [J].果树学报,2009,26(4):546-552 WANG Yan, WANG Hui-cong, ZHOU Zhi-kun, et al. An Overview of Research on Litchi Functional Role and Its Active Substances [J]. Journal of Fruit Science, 2009, 26(4): 546-552 [4] to strawberry fruit quality and their 642-647 [5] Anary Priscila Monteiro [6] Laura Villamiel, Rosina Lo′pez- Fandino. whey proteins by dextran of molecular mass [7] ,大豆科 学,2012,31(3):483-486 on Functional Characteristics of Soybean Antigenic Proteins by Glycosylation [J]. Soybean Science, 2012, 31(3): 483-486 [8] 蔡金星,刘秀凤,常学东,等.蚕豆蛋白质提取分离及其物化 —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 性质研究[J].食品工业科技,2007,28(10):142-144 Ribosome Inactivating Protein-LuffinS from Seeds ofLuffa cylindrical [J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 1998, 30(2): 142-145 [12] 闵建华,李建科,陈婷.蚕蛹多肽的制备工艺及其体外抗氧 化活性[J].食品科学,2009,30(14):123-126 MIN Jian-hua, LI Jian-ke, CHEN Ting. Preparation and Antioxidant Activity in vitro of Silkworm Pupa Polypeptide [J]. Food Science, 2009, 30(14): 123-126 [13] 罗建平,徐学玲,潘利华,等.菠萝皮渣多糖的提取与体外抗 氧化活性研究[J].食品科学,2009,30(18):172-175 LUO Jian-ping, XU Xue-ling, PAN Li-hua, et al. Extraction and in Vitro Antioxidant Activities of Polysaccharides from Ananas comosus (L.) Merr. Peel [J]. Food Science, 2009, 30(18): 172-175 [14] 裴小平,唐道邦,肖更生,等.鸡肉蛋白提取工艺研究[J].食品 科技,2009,34(8):198-202 PEI Xiao-ping, TANG Dao-bang, XIAO Geng-sheng, et al. Study on extraction process of chicken protein [J]. Food Science and Technology, 2009, 34(8): 198-202 1856 ——————————————————————————————————————