烟草及烟草制品中多酚类化合物新绿原酸4-o-咖啡奎尼酸莰菲醇基芸香苷测定超高效液相色谱法标准文本

烟草及烟草制品中多酚类化合物新绿原酸4-o-咖啡奎尼酸莰菲醇基芸香苷测定超高效液相色谱法文本 ICS 71.040 O657 备案号: DB52 贵州省地方标准 DB 52/ T XXXX—2017 草及烟草制品中多酚类化合物(新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷) 测定 超高效液相色谱法 Tobacco and tobacco products—Determination of Polyphenols (neochlorogenic acid,4-O-Caffeoylquinic acid,Kaempferol 3-O-β -rutinoside) — Ultra-High Pressure Liquid Chromatography (征求意见稿) 2017 - XX - XX发布 2017 - XX - XX实施 发布贵州省质量技术监督局 DBXX/ XXXXX—XXXX 目 次 前 言 ............................................................................. II 1 范围 ................................................................................ 1 2 规范性引用文件 ...................................................................... 1 3 原理 ................................................................................ 1 4 试剂 ................................................................................ 1 5 仪器及材料 .......................................................................... 2 6 样品制备 ............................................................................ 2 7 步骤 ............................................................................ 2 精密度和回收率 ...................................................................... 3 8 9 检验 ............................................................................ 4 附 录 A ............................................................................. 5 I DBXX/ XXXXX—XXXX 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写》给出的规则起草。 请注意本文件的某些可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中国烟草总公司贵州省公司提出并归口。 本标准起草单位:中国烟草总公司贵州省公司。 本标准主要起草人:耿召良、张婕、葛永辉、向章敏。 II DBXX/ XXXXX—XXXX 烟草及烟草制品中多酚类化合物(新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰 菲醇基芸香苷) 测定 超高效液相色谱法 1 范围 本标准适用于烟草和烟草制品中多酚类化合物(新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷)的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验 YC/T 31 烟草及烟草制品 试样的制备和水分测定 烘箱法 3 原理 采用40%的甲醇水溶液(V/V)提取烟草或烟草制品中多酚类化合物，提取液直接进行超高效液相色谱分析，采用紫外检测器定量。 4 试剂 除特殊要求外，均应使用分析纯试剂。 4.1 新绿原酸含量?97%(质量分数)。 4.2 4-o-咖啡奎尼酸、含量?97%(质量分数)。 4.3 莰菲醇基芸香苷，含量?97%(质量分数)。 4.4 甲醇，色谱纯。 4.5 冰醋酸，色谱纯。 4.6 萃取溶液:40%甲醇水溶液(V/V)。 4.7 尼龙针式滤头(0. 22 μm)。 4.8标准溶液 4.8.1 多酚标准储备液 1 DBXX/ XXXXX—XXXX 分别称取新绿原酸(4.1)、2,4-o-咖啡奎尼酸(4.2) 50.00mg，莰菲醇基芸香苷(4.3) 5.0 mg，于50mL烧杯中，用15mL甲醇(4.4)溶解，再转移至50mL容量瓶中用40%的甲醇水溶液(4.6)定容至刻度，作为新绿原酸、2,4-o-咖啡奎尼酸和莰菲醇基芸香苷的一级混合标准溶液。冷藏于4 ?保存，有效期3个月。取用时，放置于常温下，达到常温后方可使用。 4.8.2多酚标准系列溶液 取一级混合标准溶液1mL于10mL容量瓶中，用40%的甲醇水溶液定容至刻度，为多酚的二级标准溶。分别取二标准溶液0.1、0.2、0.4、1mL，一级标准溶液0.2、0.4、1mL于7个10mL容量瓶中，用40%的甲醇水溶液配置各级多酚系列标准溶液。 4.3 流动相 (V/V);流动相B:0.5%冰醋酸/甲醇(V/V) 流动相A:0.5%冰醋酸/水 5 仪器及材料 5.1 旋风式样品磨，40目筛。 5.2 分析天平，精确至 0.1 mg。 5.3 超声波振荡器。 5.4 超高效液相色谱仪，配置紫外光检测器。 色谱柱:亚乙基桥杂化颗粒C18柱;规格:1.7 μm，2.1 mm×100 mm。 6 样品制备 6.1 按照YC/T 31制备试样并测定水分含量。 7 分析步骤 7.1 样品处理 准确称取0.1 g(精确至0.1 mg)样品于置于50mL离心管中，准确加入20mL萃取溶液(4.6)置于超声波振动器中，在超声波频率40 KHz，萃取功率130 W条件下超声萃取20min，取2mL萃取液，用0.22μm微孔滤膜(4.7)过滤后待分析。 7.2 色谱分析 ——流速:0.25 mL/ min; ——柱温:30?; 2 DBXX/ XXXXX—XXXX ——进样量为1 μL; ——运行时间10 min; ——流动相条件:0min:A89%，B11%;0.3min:A73%，B27%;0.9min:A67%，B33%;2min:A55%，B 45%;4.0min:A55%，B 45%;4.1min:A20%，B 80%;5.4min:A20%，B 80%;5.5min:A89%，B 11%; ——紫外检测波长:0min:325nm;5min:348nm。 7.3 标准工作曲线 用多酚标准系列溶液(4.8.2)制作标准工作曲线。根据多酚类物质标准溶液的浓度及其响应峰面积，建立标准工作曲线，工作曲线线性相关系数应不小于0.999。 7.4 样品测定 按照色谱分析条件(7.2)测定样品(7.1)中的多酚类物质，根据保留时间定性，峰面积定量。每个样品平行测定两次。混合标准溶液和样品溶液色谱图参见附录A。 7.5 结果的计算与表述 样品中的多酚类物质含量按照式(1)进行计算。 c，V …………………………(1) X= m， (1-w)，,,,, 式中， X——每克试样中的多酚含量，单位为mg/g; c——测试样品溶液中多酚质量浓度，单位为微克毫升(μg/mL); V——萃取溶液的体积，单位为毫升(mL); m——试样质量，单位为克(g); w——试样含水率，%; 取两次平行测定值的平均值作为样品的测定结果，两次平行测定值间的相对平均偏差不应大于5%，结果精确至0.01mg/g。 8 精密度和回收率 本方法的精密度测定结果和回收率见表1，2。 表1 方法的精密度 (mg/g) 样品名称 新绿原酸 4-o-咖啡奎宁酸 莰菲醇基芸香苷 3 DBXX/ XXXXX—XXXX 1 2.66 3.66 0.82 2 2.64 3.63 0.81 3 2.67 3.67 0.82 4 2.64 3.62 0.80 5 2.74 3.75 0.82 mean 2.67 3.66 0.82 stdev 0.21 0.26 0.04 RSD% 1.59 1.41 1.04 表2 方法的回收率 (%) 成分 样品含量(μg) 加标量(μg) 加标后测定量(μg) 回收率 新绿原酸 267.08 384.16 662.57 104.3 2,4-o-咖啡奎尼酸 366.48 392.00 673.19 107.6 莰菲醇基芸香苷 81.61 81.44 670.49 95.9 9 检验报告 检验报告应包括以下内容: ——识别被测样品需要的所有信息; ——参照本标准所使用的试验方法; ——检测结果，包括各单次测定结果及其平均值; ——与本标准规定的分析步骤的差异; ——在检测中观察到的异常现象; ——检测日期; ——检测人员。 4 DBXX/ XXXXX—XXXX 附 录 A (资料性附录) 混合标准溶液和样品溶液色谱 酚类化合物的混合标样 (a)烟样(b)示意图如图A.1所示。 0.48 210.36a 0.24AU30.12 0.480.002.002.402.803.203.604.004.404.805.205.606.00分钟0.36 b 0.24 AU 210.12 30.002.002.402.803.203.604.004.404.805.205.606.00分钟 1(新绿原酸 2(4-o-咖啡奎尼酸 3(莰菲醇基芸香苷 图A.1:酚类化合物的混合标样(a)烟样(b)超高效液相色谱图 5