一种简易的促排卵周期挽救性卵子体外成熟培养技术

一种简易的促排卵周期挽救性卵子体外成熟培养技术 作者:刘晓音,金,炜,薛松果,曹少锋 单位:上海交通大学医学院附属第九人民医院, 上海 【摘要】 【目的】 探讨人类成熟卵丘细胞在未成熟卵母细胞体外成熟培养中的作用,并建立一种简易的实施技术。【】 在控制性促排卵周期有未成熟卵母细胞时,将同周期成熟卵丘复合体切出部分卵丘细胞,用1 mL注射器抽打分散细胞,贴壁培养。113个治疗周期中,298枚生发泡期卵母细胞经3种不同培养液(A。B。C)体外成熟培养(同一病人的生发泡期卵被随机分到某同一组中):第1组28个周期中73枚(A液):基础培养液+卵泡液;第2组40个周期中115枚(B液):A液 + 分散贴壁的卵丘细胞;第3组45个周期中110枚(C液):A液 + 分散贴壁的卵丘细胞 + 促卵泡生成激素 + 皮生长因子。观察其成熟率。受精率及可用胚胎获得率等。【结果】 24 h成熟率:组间比较有显著性差异(A: 45.2%, B: 61.7%, C: 78.2%, P < 0.05); 25 ~ 48 h 无显著意义。成熟卵的正常受精率在59% ~ 67%之间,组间比较 无显著差异;与第1组(54.5%,11.0%)相比,第2组 (83.3%,25.2%)。第3组(90.7%,37.3%)的卵裂率和挽救率均有显 著性差异(P < 0.05),可用胚胎获得率组间比较依次呈现上升 趋势(66.7%,82.9%,83.7%)。 【结论】 来自控制性促排卵周期 的成熟卵丘细胞经简易吹打分散后贴壁培养,可能能协同卵泡液 中或外加的生长因子,促进未成熟卵母细胞的体外成熟,而本研 究技术简易有效,可用于挽救促排卵周期的未成熟卵。 【关键词】 控制性促排卵; 未成熟卵母细胞; 体外成熟培养; 成熟卵丘细胞 中图分类号: R715.9 文献标志码: A 文章编号: 1672-3554(2010)02-0293-05 A Simple Technique for Immature Oocytes Rescue by In-vitro-maturation Culture in Controlled Ovarian Hyperstimulation Cycles LIU Xiao-yin, JIN Wei, XUE Song-guo, CAO Shao-feng, FU Yong-lun, PENG Qiu-ping,LQi-feng, KUANG Yan-ping The Centre of Assisted Reproductive Technology, Shanghai Ninth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011, China Abstract: 【Objective】 To evaluate the role of mature cumulus cells from oocyte-cumulus complex (OCC) in in-vitro maturation (IVM) and establish a new culture technique which is convenient to carry out. 【Methods】 The cumulus cells of OCC were cut off and dispersed by 1 mL syringe. The cumulus cells were co-cultured with the immature oocytes retrieved from the COH cycles after they adherent to the bottom of the dish. The immature oocytes were experienced IVM procedures in different culture media. They were divided into 3 groups(the oocytes at germinal vesicle stage from one woman were allotted to the same group randomly). Group 1(solution A): basic culture medium+ human follicular fluid (hFF); Group 2(solution B): solution A+ cumulus cells (OCC); Group 3(solution C): solution A+ OCC+ follicle stimulating hormone (FSH) + epidermal growth factor (EGF). Then, the maturation rate, fertilization rate and formation rate of available embryo were observed. 【Results】 In 113 treatment cycles, 298 immature oocytes were performed IVM with solution A, B, and C. The difference for 24 hour maturation rates among 3 groups was statistically significant (A: 45.2%, B: 61.7%, C: 78.2%, P < 0.05). There was no statistical difference for 25~48 hour maturation rates and normal fertilization rates of mature oocytes. The differences of cleavage rates and rescued embryo rates between group 1 and 2, group 1 and 3 were statistically significant (P < 0.05). The formation rates of available embryo showed an increasing trend from group 1, 2, to 3. 【Conclusion】 After being dispersed by simply beat upon with syringe and adherent culture, the mature cumulus cells from mature OCCs in COH cycles, together with growth factors in the follicular fluid or extraneously supplemented, could promote the IVM of immature oocyte. Key words: controlled ovarian hyperstimulation; immature oocytes; in-vitro-maturation; mature cumulus cells [J SUN Yat-sen Univ(Med Sci),2010,31(2):293-297] 在控制性促排卵(controlled ovarian hypers-timulation, COH)周期中普遍存在着卵母细胞发育不同步现象,除大部分成熟 卵母细胞外。还有部分处于减数分裂I(Meiosis I, MI)期和生 发泡期(germinal vesicle,GV)的未成熟卵母细胞。常规体外授 精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer, IVF/ICSI-ET) 治疗中GV期卵母细胞通常不被利用。 目前,临床IVM研究报道大多是针对多囊卵巢综合症和卵巢低反 应患者的治疗。而对人类COH周期中的未成熟卵母细胞体外成熟 培养(in-vitro maturation,IVM),少见报道。有动物实验发现,牛卵丘细胞与未成熟卵母细胞共培养能够提高体外成熟卵母细胞的发育[1]。但尚未见类似方法用于人类临床COH周期。本文拟探讨COH周期中对未成熟卵子的成熟培养技术:在添加卵泡液。激素和相关生长因子的基础上,添加同周期成熟卵母细胞的卵丘细胞并通过简易吹打分散卵丘颗粒细胞,使其贴壁生长,以改善未成熟卵母细胞体外成熟培养环境,提高IVM有效率。本研究首次将成熟卵丘颗粒细胞用于人卵的体外成熟培养,并新建了简易吹打法分散成熟卵丘颗粒细胞以贴壁培养,从而适应临床的实用性。 1 材料与方法 1.1 未成熟卵母细胞来源 本研究为来自2005年9月至2007年7月间,在本院辅助生殖科经卵巢刺激或微刺激行IVF/ICSI治疗中获得的未成熟卵母细胞,共113个治疗周期,年龄27 ~ 38岁(平均年龄 36岁)。这些病例均符合辅助生殖技术指征。 1.2 研究方法 1.2.1 未成熟卵母细胞筛选 将卵泡穿刺取卵术中,卵泡直径≤15 mm获得的卵母细胞,在体视显微镜下(NIKON,日本),先以形态学特征初步评价其成熟度,选出颗粒细胞层少且紧密排列,卵丘组织少量致密或稀疏包绕的卵母细胞,置于常规培养液中,轻柔洗涤去除血细胞。然后采用“浅微滴”方法观察, 即取3 ~ 5 。滋L培养液滴于培养皿底,加入待观察的卵母细胞,移去多余培养液,倒置显微镜 (NIKON, 日本)下200倍观察,未成熟卵母细胞可见生GV(图1A)。MI期的未成熟卵因不易观察确定,未用于本研究。 1.2.2 成熟卵母细胞评估与卵丘细胞混悬液的制备 成熟卵母细胞—卵丘复合体(oocyte cumulus complexes, OCC) 呈旭日样,放射冠与卵丘界限分明。当卵丘细胞具有黏附培养皿的倾向并表现出黏/弹特性时,则是成熟的高质量的卵母细胞[2]。选择2 ~ 3个具有丰富卵丘团块组织的成熟卵母细胞,置于盛有常规培养液的4孔培养皿内(NUCN,丹麦),用1.0 mL注射器(BD 公司)前端针头以交叉切割方法,获得部分卵丘团块组织(见图1B)。再以注射器反复抽吸,使卵丘团块组织完全分散于培养液中,并呈混悬状态,调整密度。细胞计数为:0.8 × 105 ~ 1.0 × 105个/mL[1],5 ~ 8 min显微镜观察,培养皿底可见分散为单个或多个的卵丘细胞群(图1C。1D)。12 h或次日观察,可见卵丘细胞群贴壁生长(图1E)。 1.2.3 人类卵泡液准备 本文人类卵泡液(human follicular fluid, hFF)选择自体卵泡液,来源于IVF/ICSI取卵术中首先穿刺的目标卵泡,不含冲针液。性状橙色。少血性,在200 ~ 300 × g下离心10 min取上清液(参见Chi方法[3]),置37 ?。体积分数5%的CO2饱和湿度培养箱平衡备用。 1.2.4 培养液与实验分组 本实验按组别以随机方式分组 (由于未成熟卵子数通常很少,为便于操作,一个病人的几个未成 熟GV期卵只随即放在某同一组中)对COH周期中未成熟卵子进行 体外成熟培养,常规培养液是:人输卵管液HTF 0.8 mL (Irvine scientific 2001,美国)含10%合成血清代用品SSS(Irvine scientific 99193,美国);第1组:28个治疗周期中获得的未成 熟卵母细胞73枚(平均2.61枚)。培养液(A液):HTF +10% SSS + 20% hFF;第2组:40个治疗周期中获得的未成熟卵母细胞115枚 (平均2.88枚),培养液(B液): A液 + 贴壁培养的颗粒细胞(其 制备见1.2.2);第3组:45个治疗周期中获得的未成熟卵母细胞 110枚(平均2.44枚),培养液(C液):B液 + 0.075 UI/mL卵泡刺 激素(follicle stimulating hormone, FSH; Gonal-F, Serono, 瑞士)。 2 ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF; Sigma,美国)。每组培养液总量约为1.0 mL。不同培养液的组成 及实验分组见表1。 1.2.5 体外成熟培养和授精 经形态学评价和浅微滴方法确 认的未成熟卵母细胞,先移入含有常规培养液的4孔皿内,置于 37 ?。5%CO2饱和湿度培养箱。培养1 ~ 4 h,然后移入相应培 养液培养24 h后观察。将貌似成熟的卵母细胞以机械法(毛细管 反复吹吸)去除卵周围的颗粒细胞,以明显排出极体为准判定为 成熟的减数分裂?(Meiosis ?, M?)期卵(图1F),择时以ICSI 方式授精。然后,继续培养18 ~ 20 h观察受精,24 h后观察胚 胎发育。其余未成熟卵母细胞以半量换液,即将原培养液移出2/3 量。200 × g离心5 min。取上清液预温等量加入A液,继续培养至48 h观察成熟情况。胚胎分级按参考文献[4]。 1.3 统计学处理 应用SPSS 11.5软件对数据采用 χ2检验进行处理,取α = 0.05。 2 结 果 2.1 未成熟卵母细胞体外成熟时间及成熟率 24 h成熟率:第1组73枚成熟33枚(45.2%)。第2组115枚成熟71枚(61.7%)。第3组110枚成熟86枚(78.2%),组间比较有显著性差异(P < 0.05)。25 ~ 48 h成熟率组间比较无显著性差异(表2)。 2.2 未成熟卵母细胞体外成熟ICSI检测的受精率。卵裂率。可用胚胎获得率及挽救率 本实验298枚未成熟卵母细胞中,24 h内成熟190枚,48 h内共成熟226枚。结果:第1组。第2组和第3组的24 h成熟卵正常受精率分别为66.7%(22/33)。59.2%(42/71)和62.8%(54/86),组间比较无显著性差别;3组的卵裂率分别为54.5%(12/22)。83.3%(35/42)和90.7%(49/54)。第2组。第3组与第1组相比,差异均有统计学意义(P < 0.05),第2组与第3组间差别无统计学意义。3组的可用胚胎获得率分别为66.7%(8/12)。82.9(29/35)和83.7(41/49)。3组间比较无显著性差别,但依次呈上升趋势。3组的挽救率分别为11.0%(8/73)。 25.2%(29/115)和37.3%(41/110),与第1组相比,第2组和第3组均有显著性差异(P < 0.05)。第2组与第3组间比较无显著性差别(表3)。 3 讨 论 目前应用于IVM的体外培养系统尚不完善,导致体外成熟卵子的受精率。胚胎形成率。胚胎发育潜能以及胚胎着床能力均下降[5]。然而不同的培养环境可产生不同的IVM结局[6]。目前IVM研究一般是在基础培养液如Ham-F10。TC199。HTF等中添加血清。卵泡液。激素。生长因子等[4,7]。而卵母细胞的生长发育和成熟是一个动态过程,其生长环境所需的成分也不断发生变化。因此,在IVM过程中,培养液的添加物(一种或多种)难以达到卵母细胞体外成熟的最佳条件,这可能是影响卵母细胞体外成熟及成熟后发育潜能的原因之一。Hashimoto等研究发现在培养液中添加卵丘细胞(1.6 × 106个/mL)可以促进牛有放射冠的卵母细胞发育[1]。鉴于此观点,本研究除在IVM培养液中添加了hFF或/和FSH。EGF外,还尝试添加了同周期成熟卵丘复合体的卵丘细胞。特别是,本研究采用1 mL注射器对切割成小块的卵丘组织细胞进行吹打分散,操作简单易行。这些细胞混悬液,在含卵泡液或/和EGF生长因子培养基中易于贴壁,从而生长状况良好,亦可释放部分由卵丘细胞自身合成的生长因子等物质,促进卵母细胞的胞质成熟[8]。 卵泡液中含有卵母细胞自然成熟所具备的全部成分和因子 [4]。本研究在3个实验组的培养液中都添加了20%自体卵泡液(hFF),最低组(第1组)的成熟率亦有45.2%。这说明卵泡液确实有一定促进卵母细胞成熟的作用。而从24 h内(GV期)卵母细胞成熟率看,第2组和第3组均显著高于第1组(P < 0.05)。这表明利用成熟卵丘细胞作饲养层并添加卵泡液和/或因子,可明显提高24 h的成熟率,分别高达61.7%。78.2%,接近其它报道的48 h成熟率(分别为65.69%[9]和76.9%[4]),而在本研究中,这两组48 h的成熟率更高,分别为78.3%和84.6%。已有研究报道单纯的FSH。EGF加入(不添加成熟卵丘细胞)对MI期卵体外成熟有明显促进作用[10]。本研究因卵子数相对较少而分组较多,未将单纯的FSH。EGF加入列入分组。但从成熟速度来看,FSH。EGF与成熟卵丘细胞一起促使GV期卵子在24 h成熟率高达78%,与李媛等[10]报道的FSH。EGF促MI期卵28 ~ 30 h的成熟效果(78.6% ~ 83.8%)相当。因此,这间接说明FSH。EGF与成熟卵丘细胞对卵子成熟可能有协同作用,其成熟速度和成熟率获得了良好效果。 0 ~ 24 h培养成熟的卵母细胞行ICSI显微授精结果显示: 接近文献报道。IVM后行受精率组间比较无显著性差异(表3), ICSI操作,受精率可达到60%以上[11]。这可能与体外成熟卵母细胞的胞核。胞质成熟度相关。卵裂率第2组。第3组与第1组相比,差异均呈显著性。可用胚胎获得率在3组间比较依次呈现上升趋势。这些结果可能提示添加成熟卵丘细胞和FSH。EGF等 成分促进胞质成熟,激发胚胎发育潜力。本研究所用卵母细胞体 外成熟培养方法可以挽救性获得25%(29/115) ~ 37%(41/110)的 可用胚胎,增加可用胚胎数,显著高于对照组的11.0%(8/73)。随 着人们对促排卵周期卵巢反应认识的深入[12]及对卵巢组织冻 存技术的提高[13],对于卵子成熟的机制将进一步发展,而未成 熟卵的体外成熟并利用也将得到加强。本研究提供的简易有效的 技术将为这些基础研究或临床应用带来便捷的手段。 【参考文献】 Hashimoto S, Saeki K, Nagao Y, et al. 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