人参多糖含量测定方法研究 前沿论文

人参多糖含量测定方法研究 前沿论文 人参多糖含量测定方法研究 王丹，吕永磊，卜海博，徐丽媛，李向日 (北京中医药大学中药学院，北京 100102) 5 摘要:目的:建立人参多糖含量测定方法。方法以人参精制多糖测得人参多糖对葡萄糖的换 算因子，以苯酚-硫酸分光光度法测定人参多糖的含量。结果:供试液在 2h 内显色稳定，重 现性好，平均回收率为 99.8%，RSD=2.57%。人参多糖含量为 28.56%，RSD 为 1.81%。结论: 该方法简便，快速，测定结果客观，准确。 关键词:中医学;人参;多糖;含量测定;精制 10 中图分类号:R284.1 Content Determination of Polysaccharide in the root of Panax ginseng WANG Dan, LV Yonglei, BU Haibo, XU Liyuan, LI Xiangri 15 (School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100102) Abstract: Objective:To establish a method for content determination of polysaccharides in the root of Panax ginseng .Method:The conversion coefficient of ginseng polysaccharide to glucose was obtained by refined polysaccharides, and then the content of crude polysaccharides in the root of 20 Panax ginseng was determined by the method of phenol-sulferic acid. Result:the color of the treated solution showed good stabilization within 2h and the average value of the recovery for polysaccharide measurement was 99.8% with 2.57% of RSD . The contents of polysaccharide in the root of Panax ginseng was 28.56% with 1. 81% of RSD. Conclusion :The method was simple, rapid and accurate 25 Keywords:traditional Chinese medicine; Panax ginseng; polysaccharide; Content determination; Refining 0 引言 人参为五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Mey)的干燥根，在我国有悠久的药用历史， 30 人参中主要含有人参皂苷、人参多糖、挥发油、氨基酸及微量元素等有效成分。据研究报道， [1,2]人参多糖对机体的免疫功能、造血功能以及在抗肿瘤和降血糖等方面均有作用。本文采 用苯酚—硫酸法来测定人参多糖的含量，以葡萄糖为对照品，绘制标准曲线，并采用换算因 [3]子来提高方法的准确度。为了保证测定换算因子方法的准确性，本文测定了人参精制多糖 13的 C-NMR 谱以及反映人参多糖精制前后单糖组成的 HPLC，在验证人参精制多糖中基本 35 不含其他杂质且单糖组成与粗多糖基本相同的基础上，以人参精制多糖测得人参多糖对葡萄[4]糖的换算因子，再以此校正采用苯酚—硫酸法测定的人参中多糖的含量。 1 仪器与试药 1.1 仪器 TMWaters 1525 HPLC 色谱仪:Waters2489 紫外双波长检测器,breeze2.0 色谱工作站(美 40 国 Waters 公司);AV?600 型超导屏蔽核磁共振仪(德国 Bruker 公司);紫外-可见分光光 基金项目:国家自然基金面上项目(81073041);高等学校博士学科点专项科研基金(20100013120010) 作者简介:王丹，(1986-)，女，硕士研究生，主要研究方向:中药炮制与质量控制的研究 通信联系人:李向日，(1972-)，女，副教授，主要研究方向:中药炮制、活性成分及质量控制的研究. E-mail: lixiangri@sina.com 度仪(北京普析通用仪器有限公司);TDL-5-A 低速台式大容量离心机(杭州汇尔仪器设 备有限公司)。 1.2 试剂与试药 人参(生晒参)，产地宽甸太平哨镇，经北京中医药大学李向日老师鉴定为五加科植物 45 人参。 D-葡萄糖(Glc，110833-200503))半乳糖(Gal，100226-200404))D-半乳糖醛酸(GalA， 111646-200301)、D-木糖(Xyl，111508-200404)、阿拉伯糖(Ara，1506-200001)均购自 中国药品生物制品鉴定所;重蒸酚)双氧水)乙醇)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP))三氟 乙酸(TFA)均为纯;乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。 50 2 方法与结果 2.1 人参精制多糖的制备 称取人参粉末(过四号筛)10g，加入 80%乙醇 500mL，回流提取 2 次，每次 1h，脱脂， 过滤，药渣挥尽乙醇后，沸水提取两次，每次提取 2h，离心(5000r/min,10min)，合并上清液， 浓缩至 100mL，加乙醇使醇含量达到 80%，于 4?冰箱中过夜，过滤，干燥，即得到人参粗 55 多糖。 将粗多糖以水复溶，与等体积 Sevage 试剂(氯仿:正丁醇=4:1)混合，振摇)离心，除去 蛋白，先在 200,400nm 紫外光谱段进行扫描，260,280nm 处无吸收峰，再用考马斯亮蓝 [5]法测蛋白，反复进行 5 次至无蛋白。浓缩溶液至 50mL，加入体积分数 30%的过氧化氢原 -1 液，用 0.5mol?L的氢氧化钠调节其 pH 至 8,9，45?水浴 4h，将多糖脱色液置于透析袋 60 中，先流水透析 1d，再蒸馏水透析 3d。流水透析后过滤，浓缩，加乙醇使醇含量至 80%， 于 4?冰箱中过夜，过滤，滤渣依次用无水乙醇)丙酮)乙醚洗涤 3 次，50?真空干燥，即 [6]得精制多糖。 13人参精制多糖的 C-NMR 图谱(溶剂为 DO)见图 1，化学位移 100 的信号为糖的端基碳 2 信号，18 的为糖的甲基碳信号，50,80 的为除上述碳信号外糖上其他的碳信号，除上述糖 65 信号外，未见其他信号，由此可判断精制的人参多糖中基本不含蛋白质等其他杂质。 13图1 人参精制多糖C-NMR图 13 Fig1 C-NMR Spectrum of refined polysaccharide In Panax ginseng 70 2.2 PMP 衍生化法测定粗多糖和精制多糖的单糖组成 2.2.1 衍生化供试品的制备 -1 精密称取人参粗多糖 10mg 和精制多糖 5mg，加入 2mol?L三氟乙酸 1mL，氮气封管， 于 100?水浴 6h，从中取出 400μL 置具塞试管中，氮气吹干，吹的同时反复加入甲醇以除 -1 -1 净三氟乙酸。在水解供试品中加 0.3mol?L氢氧化钠溶液和 0.3mol?L的 PMP 甲醇溶液 -1 75 各 100μL，混匀后于 70?水浴 100min，冷却至室温后加 0.3mol?L盐酸 100μL 中和，加 水至 1mL，最后加入等体积三氯甲烷除去未反应的 PMP，重复 3 次。水相分别以 0.45μm [7]滤膜过滤后备用。 2.2.2 HPLC 条件 -1 Agilent C色谱柱(4.6mm×250mm，4μm);流动相 18%乙腈-82%0.1mol?L磷酸盐 18 -180 缓冲液(pH6.7);紫外检测器;检测波长 250nm;流速 1mL?min;进样量 20μL。人参粗 多糖和精制多糖的 PMP 衍生物 HPLC 图分别见图 2。由图 2 可知，人参多糖精制前后多糖 组成没有明显变化。 A 85 B 图 2 人参粗多糖和精制多糖 PMP 衍生物 HPLC 图 Fig2 Chromatograms of PMP derivatives of hydrolyzates of Polysaccharide and refined polysaccharide in Panax inseng g 90 A 人参粗多糖 (crude polysaccharide in Panax ginseng) B 人参精制多糖(refined polysaccharide in Panax ginseng) 1.PMP 3.半乳糖醛酸(GalA)4.葡萄糖(Glc)5.半乳糖(Gal)6.木糖(Xyl)7.阿拉伯糖(Ara) 2.3 供试品溶液的制备 95 精密称取人参粉末(过四号筛)0.4g，加入 80%乙醇 50mL 回流提取二次，每次 1h，滤 渣挥尽乙醇后，用 50mL 热水回流提取 2 次，每次 2h，过滤，合并水提液，加乙醇使醇含 量至 80%，于 4?冰箱中过夜。过滤，得到粗多糖，将粗多糖溶于水，定容至 250mL 容量 瓶中，精密移取 5ml 至 10ml 容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀，为供试品溶液。 2.4 最大吸收波长的选择 -1 精密量取供试品和葡萄糖对照品溶液(0.09 g?L的葡萄糖溶液)各 1.0mL，置 20mL 100 试管中，加入 5%苯酚溶液 1.0mL，浓硫酸 8.0mL，混匀后室温下放置 5min，沸水加热 30min， 冷至室温，以蒸馏水替代多糖溶液如上法配制空白，在 400,600nm 范围内扫描，确定最大 吸收波长。对照品最大吸收波长在 483nm，供试品最大吸收波长都在 487nm，综合考虑，选 择测定波长为 487nm。 400,600nm 全波长扫描图见图 3。 105 1.葡萄糖(glucose) 2.人参多糖(polysaccharide) 图 3 葡萄糖对照品和人参多糖供试品全波长扫描图 Fig3 ,,spectrum of glucose and Polysaccharide in Panax ginseng 2.5 标准曲线的绘制 110 精密称取葡萄糖对照品 9.336mg 定容至 100mL 容量瓶中，精密量取此溶液 10ml 于 50ml 容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，分别精密量取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0ml 于 10ml 容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，配成系列标准溶液。 精密量取 1mL 系列标准溶液于具塞试管中，以蒸馏水作空白，分别加入 5%苯酚溶液 1mL，浓硫酸 8mL，摇匀，放置 5min，沸水加热 30min，冷至室温，于 487nm 处测定吸光 度。经计算得回归方程:Y=47.187X+0.0156，r=0.9991，葡萄糖在 18.6μg 到 149.3μg 之间 115 呈良好的线性关系。 2.6 换算因子的测定 精密称取人参精制多糖 5mg，100mL 容量瓶定容，摇匀。精密量取 1mL 于具塞试管中， 按照“2.4”项下显色方法显色并测定吸光度，根据回归方程计算多糖溶液中葡萄糖的浓度， -1 按 f=W/C?D 计算换算因子，其中 W 多糖质量(mg)，C 为多糖中葡萄糖浓度(mg?mL)，D 为稀释倍数。测得换算因子 f=1.74(n=5)。 120 2.7 精密度试验 精密量取葡萄糖标准溶液 1mL，按“2.4”项下方法显色并测定其吸光度，平行测定 6 125 份，结果 RSD=1.03%，明精密度良好。 2.8 稳定性试验 按照“2.3”项下提取方法制备 1 份供试品溶液。精密量取供试品溶液 1mL，置具塞试 管中，按照“2.4”项下方法显色并测定吸光度，每隔 1h 测定 1 次，连续 3h，测得吸光度的 为 1.09%，表明供试品溶液在 2h 内显色稳定。 RSD 130 2.9 重复性试验 按照“2.3”项下提取方法同时制备 6 份供试品溶液。精密量取各供试品溶液 1mL,分别 置于具塞试管中，按照“2.4”项下方法显色并测定吸光度，结果 RSD 为 3.01%，表明该方 法重复性良好。 2.10 加样回收率试验 精密称取 6 份人参粉末(过四号筛)各 0.2g，分别加入精制多糖约 22mg，按照“2.3” 135 项下制备供试品溶液和“2.4”项下方法显色并测定吸光度，计算回收率，结果平均加样回 收率为 99.8%，RSD 为 2.57%。 2.11 人参多糖含量的测定 精密称取人参粉末 0.4g，按照“2.3”项下提取条件提取和“2.4”项下显色条件显色， 测定吸光度，由回归方程计算供试品溶液中葡萄糖浓度，按含量(%)=(C*D*f/W)×100%计算 供试品中多糖的含量。式中:C 为供试品溶液中葡萄糖的浓度，D 为稀释倍数，f 为换算因 140 子，W 为供试品干重质量。结果人参多糖含量为 28.56%，RSD=1.81%(n=4)。 3 讨论 本研究对人参多糖含量测定的提取条件的加水量)提取次数进行了单因素考察，同时也 对苯酚-硫酸法中的 5%苯酚用量)硫酸用量)沸水加热时间进行了正交实验考察，结果优选 出的最佳提取条件和显色条件。 利用精制多糖测得多糖对葡萄糖的换算因子，可消除单纯以葡萄糖为标准计算多糖含量 145 带来的误差，而以往人参多糖含量测定文献只做了这一步，未对精制多糖的纯度进行评价， 13也未对精制前后的单糖组成进行验证。本文测定了人参精制多糖的 C-NMR 谱，结果表明 其中已基本不含蛋白质等其他杂质，并采用多糖 PMP 柱前衍生化法，HPLC 法检测其粗多 糖和精制多糖的单糖组成，表明人参多糖在精制前后其组成未见明显变化。 人参多糖中的单糖除了葡萄糖外，还有半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖和木糖等，不同 单糖在苯酚-硫酸显色时其吸光度不同，造成标准曲线的斜率不同，因此单纯以葡萄糖计多 150 糖含量就有误差，本文以精制多糖测得多糖对葡萄糖的换算因子，消除了单纯以葡萄糖为标 准计算多糖含量带来的误差，提高了实验结果的准确性。 13C-NMR 谱和 PMP 衍生化 HPLC 法的结果，保证了采用换算因子计算多糖含量的准确 性，对多糖含量测定具有指导意义，为人参的综合应用和质量评价提供科学的依据。 155 [参考文献] (References) 160 [1] 张彬，林瑞超，冯芳.人参多糖的研究概况[J].中国药事，2004，18(9):566. 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