叶绿素a测定
实验三 富营养化湖中藻量的测定(叶绿素a法) 一、实验目的
富营养化湖由于水体受到污染,尤以氮磷为甚,致使其中的藻类旺盛生长。此类水体中代表藻类的叶绿素a浓度常大于10微克/升。
本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素a浓度,以考查其富营养化情况。
二、器材与用品
1、分光光度计(波长选择大于750nm,精度为0.5,2nm)。 2、比色杯(1cm;4cm)。
3、台式离心机(3500r/min)
4、离心管(15ml具刻度和塞子);冰箱
5、匀浆器或小研钵。
6、蔡氏滤器;滤膜(0.45微克,直径47mm)。
7、真空泵(最大压力不超过300kpa)。
8、MgCO悬液:lg MgCO细粉悬于100ml蒸馏水中。 33
9、90,的丙酮溶液:90份丙酮,10份蒸馏水。
10、水样:两种不同污染程度的湖水水样各2L. 三、方法和步骤
1、按浮游植物采样方法,湖泊、水库采样500ml,池塘300ml。采样点及采水时间同“浮游植物”。
2、清洗玻璃仪器:整个实验中所使用的玻璃仪器应全部用洗涤剂清洗干净,尤其应避免酸性条件下而引起的叶绿素a分解。 3、过滤水样;在蔡氏滤器上装好滤膜,每种测定水样取50,500ml减压过滤。待水样剩余若干毫升之前加入0.2ml MgCO3悬液、摇匀直至抽干水样。加入MgCO可增进藻细胞滞留在滤3
膜上,同时还可防止提取过程中叶绿素a被分解。如过滤后的载藻滤膜不能马上进行提取处理,应将其置于干燥器内,放冷(4?)暗处保存,放置时间最多不能超过48小时。 4、提取;将滤膜放于匀浆器或小研钵内,加2,3ml90,的丙酮溶液,匀浆,以破碎藻细胞。然后用移液管将匀浆液移入刻度离心管中,用5ml90,丙酮冲洗2次,最后向离心管中补加90,丙酮,使管内总体积为10ml。塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物,充分振荡,放冰箱避光提取18,24小时。 5、离心:提取完毕后,置离心管于台式离心机上3500r/min,离心10min,取出离心管,用移液管将上清液移入刻度离心管中,塞上塞子,3500r/min在离心10min。正确记录提取液的体积。
6、测定光密度:藻类叶绿素a具有其独特的吸收光谱(663nm),因此可以用分光光度法测其含量。用移液管将提取液移入1cm比色杯中,以90,的丙酮溶液作为空白,分别在750、663、645、630nm波长下测提取液的光密度值(OD)。注意:样品提取的OD值要求在0.2与1.0之间,如不在此范围663
内,应调换比色杯,或改变过滤水样量。OD小于0.2时,应663
该用较宽的比色杯或增加水样量;OD大于1.0时,可稀释提663
取液或减少水样滤过量,使用1cm比色杯比色。 7、叶绿素a浓度计算:将样品提取液在663、645、630nm波长下的光密度值(OD OD OD)分别减去在750nm下的光663645630
密度值(OD),,此值为非选择性本底物光吸收校正值。叶绿750
素a浓度计算公式如下:
(1)样品提取液中的叶绿素a浓度Ca为:
Ca(微克/升),11.64(OD,OD),2.16(OD,OD)663750645750+0.1(OD,OD 630750
(1) 水样中叶绿素a浓度为:
叶绿素a(微克/升),Ca×v/(V×L)
2) (
叶绿素a(微克/升),Ca×v/V×L
Ca:样品提取液中叶绿素a浓度(微克/升)
v :90,丙酮提取液体积(ml)
V:过滤水样的体积(L)
L:比色杯宽度(cm)
四、实验
将测定结果记录于表4,1中
表4,1 测定结果
叶绿素a
水样 OD OD OD OD (微克/750663645630
升)
A湖水
B湖水
根据测定结果,参照表4,1中指标评价被测水样的富营养化程度。
表4,2 湖泊富营养化的叶绿素a评价
类 型
指 标 贫营养型 中营养型 富营养型
叶绿素a(微克/升) ,4 4,10 10,150 五、思考
1、比较两种水样中的叶绿素a浓度,通过本实验你的结论是什么,
2、如何保证水样叶绿素a浓度测定结果的准确性,主要应注意哪几个方面的问题,