思考题

第一章：基因工程概述 1． 重组DNA技术、分子克隆技术与基因工程在概念上的主要区别是 重组DNA技术：即分子克隆技术，指将某一生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入到另一生物体（受体）细胞中，使之按照人们的意愿稳定遗传和表达相应新产物或新性状的体外操作程序。 基因工程：重组DNA技术的产业化设计和利用，这里既包括上游技术（重组DNA技术），也包括下游技术（发酵和基因产物的分离和纯化）。   2．基因工程的三大要素是什么 供体载体受体   3．重组DNA技术的五大单元操作过程分别是什么 切：从供体细胞中分离基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体切开 接：用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到载体分子上，构成重组DNA分子 转：借助于细胞转化手段将重组DNA分子导入受体细胞中 增：短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到染色体DNA上 检：筛选和鉴定经过转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定表达的工程菌。   4．简述外源基因稳定高效表达的主要战略思想 1．提高拷贝数 2．提高转录量。 3．提高翻译量 4．提高工程菌的生产   6．试比较四代基因工程的基本定义 第一代 蛋白质多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代 蛋白质编码基因定向突变 蛋白质工程 第三代 代谢信息途径的修饰重构 代谢途径工程 第四代 全基因组或染色体转移 基因组工程       7．如何理解重组DNA的安全性 载体：不使用结合型质粒，而用安全的非结合型质粒。 受体：受体采用具有湖泊型突变体校正功能的大肠杆菌   8．简述基因工程（包括重组DNA技术）的三大用途。 1 分离、扩增、鉴定、研究、整理基因信息资源 2 规模化生产活性物质 3 设计构建生物新性状甚至新物种     第二章：DNA重组克隆的单元操作 1．用于DNA重组克隆的载体的功能是什么 1．运送外源基因进入受体细胞 2．为外源基因提供复制或整合能力 3．外源基因提供扩增和表达的必要条件 必须具备四个条件： 1． 丰富的酶切位点 2． 对受体细胞有可转移性 3． 在受体细胞中稳定遗传 4． 具有合适的标记，便于检测。   2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么 自主复制性：不依赖于染色体DNA，自主复制 可扩增性：G-菌种松弛型复制和严谨型复制 可转移性：结合性，能转移到另一菌体中，基因工程用非结合型 不相容性：对已经侵染的质粒或类似质粒免疫   3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义 具有相同或类似复制子结构或调控模式的两种不同质粒不能稳定存在于同一个受体细胞中   4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途 高拷贝 突变拷贝基因，拷贝数1000-3000，用于扩增基因 低拷贝 来自pSC101，拷贝数低于10，表达毒性基因 温敏 在不同温度下表现出不同的拷贝数 测序 含有测序通用引物互补序列与多酶接头 整合 装有整合促进基因和位点，便于外源基因整合到染色体DNA上 穿梭 装有针对两证不同受体的复制子，便于基因克隆 表达 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化原件 探针 装有报告基因便于启动子等原件克隆筛选 COS质粒 由λ-DNA的cos区域质粒DNA重组组成。     5． II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么 分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别和切割位点具有严格特异性   6．在DNA重组克隆实验中为什么通常使用T4-DNA连接酶而不用其他连接酶 1．有更广泛的底物适应性 2．修复DNA-DNA链上的单链缺口（大肠杆菌也有）、DNA-RNA杂交链上的缺口 3．连接平头双链DNA分子   7． KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别 大肠杆菌DNA聚合酶I在枯草杆菌蛋白酶处理下获得的C端2/3的肽段。 Klenow酶： 具有5’→3’DNA聚合酶活性，3’→5’核酸外切酶活性，缺失5’→3’核酸外切酶活性   8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？ 1.温度、盐度等物理因素 2.DNA样品纯度 3.DNA甲基化程度 4.限制性核酸内切酶的缓冲液性质. Star 活性：极端条件下限制性核酸内切酶的专一性变低，会识别和切类似切口。   9．如何理解粘性末端比平头末端更容易连接 粘性末端在退火条件下为分子内反应 平头末端是分子间反应，反应更加复杂，速度也慢   10．在重组DNA技术中常使用的微生物转化方法有哪些？ G-菌：Ca2+诱导转化（形成液晶，便于DNA分子进出） 有细胞壁：PEG介导（先溶酶体去壁，加入DNA转化，再生细胞壁） 电穿孔：电场脉冲下直接处理。   11．为什么外源DNA难以转化野生型的微生物受体细胞 1.外源DNA会被识别，从而被降解 2.即使被转化进去，重组质粒的逃逸 3.转座元件促使重组DNA的缺失和重拍 4.影响细胞代谢，使得工程菌生长慢于普通菌。   12．简述转化率和重组率的基本概念以及在DNA重组克隆实验中的指导意义。 转化率：每微克载体DNA转入受体细胞的分子数 重组率：含有外源DNA的重组分子数/载体分子数(一般25%-70%) 指导意义: 某DNA重组实验的重组率为20%转化率为107每微克,经过处理后的载体转化率吧要比天然的降低100倍.要获得104个重组克隆,需要多少载体DNA进行重组实验: 解: 处理后的重组DNA转化率=105每微克 重组率100%条件下需要：104/105=0.1微克 0.1/20%=0.5微克载体DNA   13．简述转化子筛选与重组子鉴定的三大基本战略 载体遗传标记检测 抗药性检测 营养缺陷型检测 显色筛选 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 菌落原位杂交法 PCR扩增法 DNA序列法 外源基因产物检测 蛋白质生物功能检测法 DNA结合蛋白检测法southern western检测 抗菌素抗性鉴定 放射免疫原位杂交鉴定 免疫沉淀 聚丙烯酰胺凝胶法，找粗条带     14．探针、引物、接头的物质基础和用途分别是 探针 小段单链DNA或RNA 用于检测与其互补的核酸序列 引物 小段单链DNA或RNA 作为DNA复制的起点 接头 平头双链DNA 更换粘性末端       15．简述分离克隆目的基因四大战略及其适用范围 鸟枪法 原核细菌目的基因的克隆   cDNA法 获得mRNA，除去内含子   PCR法 知道基因的两侧序列或中间序列   化学合成法 知道全基因序列         16．简述基因文库的基本概念以及构建技术要点。 基因文库 含有全部基因 鸟枪法获得 cDNA文库 含有全部蛋白质编码基因 cDNA法获得 基因文库的完备性：f增大 N增大用装载量大的装载体 N克隆数=ln（1-P出现在基因文库中的概率）/ln（1-f克隆片段平均大小/生物基因组大小）       第三章：大肠杆菌的基因工程 1．  简述外源基因在大肠杆菌中高效表达的基本原理 包括：强化蛋白质生物的合成（拷贝数、转录水平、mRNA的翻译控制）、抑制蛋白质产物的降解、维持和恢复蛋白质特向异性空间构象三方面。 生物合成: 启动子：（DNA→RNA）启动子的筛选、启动子最佳距离（Bal31）、操纵基因 终止子：（DNA→RNA）强启动子结合强终止子 SD序列：（RNA→蛋白质）mRNA起始翻译区域 密码子：（RNA→蛋白质）偏爱性，tRNA含量 拷贝数：高拷贝提供多基因   2．  决定密码子偏好的主要因素是什么？ 1.碱基数量（有些偏好GC有些偏好AT） 2.20种tRNA的丰度在不同细胞内是不一致的。 解决密码子偏好性有两种： 1改变外源基因中的部分碱基，使其符合宿主细胞的偏好性 2将编码缺失tRNA的基因装在其他载体中先行转录表达   3．  包含体的基本特征和形成机制是什么 包涵体基本特征：在某些生长条件下，特殊的生物大分子致密的聚集在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性结构称为包涵体。大量来不及折叠的多肽链靠疏水键结合。 形成机制： 折叠状态下的蛋白质聚集作用 非折叠状态的蛋白质聚集作用 蛋白质折叠中间体的聚集作用 影响因素： 温度 表达水平 细菌遗传性状 异源蛋白氨基酸序列   4．  简述外源基因在大肠杆菌中的几种主要的表达方式和优缺点 包涵体型异源蛋白表达 1简化外源基因表达产物的分离操作-离心 2能在一定程度上保持表达产物的结构稳定----蛋白酶不在构成威胁 致命缺陷：丧失了原有的生物活性 分泌型异源蛋白表达 1目的蛋白稳定性高 2目的蛋白易于分离 3目的蛋白末端完整 （末端不再含有甲硫氨酸残基） 表达率通常要比包涵体方式少得多。且大肠杆菌对真核生物的蛋白质分泌机制不健全，难以表达 融合型异源蛋白表达（N-受体蛋白-异源蛋白-C） 目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离亲和层析 目的蛋白表达率高一套表达元件 目的蛋白溶解性好良好的空间构象 目的蛋白需要回收（需要裂解和进一步分离才能获得目的蛋白，还需要回收最花成本） 寡聚型异源蛋白表达 目的蛋白高效表达 稳定表达的小分子短肽 【多拷贝外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上】 目的产物回收困难（需要裂解，但容易出现裂解后的短肽序列不均一性） 整合型异源蛋白表达 整合到染色体DNA上 目的基因稳定表达、不丢失 目的基因表达率低 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 外源蛋白稳定存在 需要对受体细胞进行缺陷抗性或缺陷改造       5．  如何从重组的融合蛋白中回收目标蛋白 融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体会引起免疫反应，因此一般要除去，主要有两种方法 A化学断裂法：最佳试剂→CNBr（与多肽链中甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，从而导致不稳定，在水的作用下断裂）--回收率高、专一性强、目标蛋白N端不含甲硫氨酸残基。（要求外源蛋白中不含有甲硫氨酸残基） B酶促裂解法： 单残基位点：断裂效率更高，同时每种蛋白均具有相应的断裂位点决定簇，在精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键（要求外源蛋白质分子中不含有精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基，但大分子蛋白质上述三种残基出现的概率不低） 多残基位点：在受体蛋白和外源蛋白之间加一段（lle-Glu-Gly-Arg）寡肽序列的人工接头片段，该寡肽片段和凝血因子Xa识别和作用，断裂点在Arg的c末端，用此法可以使得外源蛋白质不含上述寡肽链。或用肠激酶EK，在pH4.5-9.0较广范围内制动断裂   6．  影响外源基因在大肠杆菌中高效且活性表达的主要因素有哪些？ 1。DNA进入时，限制性核酸内切酶作用 2。多拷贝数和表达率的权衡 3。异源蛋白被蛋白酶降解 4。异源蛋白被形成内涵体，变性 5。异源蛋白被结合，不易分离等   7．  简述包涵体复性工作的原理 主要任务是 1将多肽链中拆开的游离巯基重新折叠 2通过次级键的形成使蛋白质复性 复性操作： 方法1：一步稀释法，蛋白质毒性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大 方法2：分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生 方法3：试剂添加法，精氨酸，甘氨酸，甘油，蔗糖，PEG，Ca2+ 方法4：蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白质带负电，抑制聚集 方法5：产物隔离法，江边形的蛋白质分子固定化，避免其互相碰撞 方法6：分子伴侣法，分子伴侣专一性帮助多肽正确折叠成正确构象 重折叠： 适合那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质折叠→化学氧化法（A） 需要还原型和氧化型谷胱甘肽，实用性较广，重折叠效果好→二硫键交换（B）   9．简述大肠杆菌工程菌遗传不稳定性的主要表现形式和解决途径 不稳定性表现在 1结构不稳定（缺失、重拍、修饰） 2分配不稳定（逃逸） 不稳定主要原因： 1受体细胞中含有大量限制性核酸内切酶，对外源DNA降解作用 2重组分子中含有基因高效表达严重干扰细胞的正常生长 3重组分子尤其是重组质粒在细胞分裂时不均匀分配导致重组DNA分子逃逸 4受体细胞中的转座元件使得重组DNA片段的缺失重排。 解决途径： 1改进载体受体系统 2施加选择压力 3控制目的基因的过量表达 4优化基因工程菌的培养工艺   酶系 用于核酸操作的酶有哪些：1限制性核酸内切酶2DNA连接酶3DNA聚合酶4核酸酶5核酸修饰酶 限制性核酸内切酶定义：能够特异性的识别双链DNA某段特殊序列，并切割DNA双链的酶，主要存在于原核细菌中。主要作用有:1保护自身的DNA不受限制2破坏外源DNA使之迅速降解 限制性核酸内切酶的命名：属名+种名+株名寄主微生物属名的头一个字母（大写）种名前两个字母（小写） II类限制性核酸内切酶特性：特异性识别特定回文序列，并在识别序列里或附近切割DNA双链。一般会产生3’-OH粘性末端（Pst1）、或5’-P粘性末端（EcoR1）、或平头末端（Pvu11） 1U限制性核酸内切酶活性：在最适宜条件下反应1小时，完全水解1微克双链DNA所需的限制性核酸内切酶的量 不同盐度选择同时酶切还是先后酶切，处理：盐度相同：同时酶切，注意识别位点盐度不同，若要同时酶切，则选择贵重酶盐度，加大普通酶浓度，不同时酶切：先低盐度后高盐度或者先用一种缓冲液，再换一个缓冲液。 影响限制性核酸内切酶活性的因素：1物理因素：温度 pH等2DNA分子的纯度3DNA分子的甲基化程度（有识别序列，限制酶不一定能酶切成功）4缓冲液的性质。（反应体系甘油浓度不能超过50%） Star activity：指在极端条件下，限制性核酸内切酶的特异性降低，可以识别和剪切相似或类似序列的现象。 DNA连接酶：可以修复DNA双链的Nick的酶DNA连接酶不能够连接两条单链DNA分子，也不能连接环状单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。（只能修补Nick，不能修补Gap） T4-DNA连接酶：1可以修复DNA双链的Nick 2可以修复DNA-RNA杂交双链的Nick 3 可以连接平头末端 1U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全连接1微克λ-DNA所需要的DNA连接酶酶的数量。 为什么粘性末端连接比平头连接简单：因为在复性条件下，粘性末端之间的连接属于分子内反应，而平头末端间的反应属于分子间反应，所以反应速度慢得多。粘性末端（低温连接，有利于氢键形成）平头末端（37℃高温连接增加末端碰撞几率） 5’-3’DNA聚合酶活性：单链DNA模板，带3’-OH的DNA引物 3’-5’核酸外切酶活性：切割5’-P端的双链上的核苷酸 5’-3’核酸外切酶活性：校正作用 DNA聚合酶：以一DNA单链为模板合成另一条链时，起将dNTP连接到链上的酶的分子。 大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA pol 1）缺口前移标记法（Nick translation）制备32P标记的探针：当双链DNA出现缺口时，DNA聚合酶的5’-3’DNA聚合酶活性会在3’-OH端开始添加脱氧核糖核苷酸（用α-32P-dATP标记即可），而与此同时3’-5’DNA外切酶活性会从5’-P端将切除原有的核苷酸，从而切口前移。 Klenow酶：大肠杆菌DNA聚合酶I经过枯草杆菌蛋白酶处理后的C端2/3的大肽段，有5’-3’DNA聚合酶活性3’-5’核酸外切酶活性。用途：1补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端2在cDNA克隆中，用于合成第二链3应用sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序 T4-DNA聚合酶1.5’-3’的DNA聚合酶活性和3’-5’的核酸外切酶活性2.无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切→切除3’-OH粘性末端3.只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止。4.四种dNTP都在时DNA聚合酶活性占主导地位。 反转录酶5’-3’聚合活性用mRNA的poly（A）做模板，合成cDNA。 核酸酶 单链核酸内切酶：S1核酸酶来自稻谷曲霉素 Zn2+为必须[注意限制性核酸内切酶为Mg2+] 内切单链DNA或RNA 带有Nick的，切除；带有gap的，切除。 单链内切双链外切核酸酶：Bal31核酸酶来自艾氏交替胞菌 Ca2+依赖有Nick，Gap切除，完整双链的话进行外切。用途：诱发DNA连续缺失突变，可以探测基因的左边界和右边界，基因定位；缩短DNA分子长度 核酸修饰酶： 末端脱氧核苷酰转移酶：TdT  Mg2+依赖时  给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚尾巴。   平末端必须是Co2+作用下TdT才能使得其发生反应。 碱性磷酸单酯酶CIP BAP 催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，换成5’-OH  作用有：在DNA体外重组中为了防止线性化载体分子发生自我环化，用该酶处理即可。 T4多核苷酸磷酸激酶T4-PNP 和碱性磷酸单酯酶合作使用，可以做到末端标记。主要思路是，先用碱性磷酸单酯酶处理掉5’-磷酸端，再用T4-多核苷酸磷酸激酶处理，加上5’-同位素标记的磷酸基团。适用于单链，双链，DNA RNA