HPLC法测定维生素BT的有关物质
药物分析杂志ChinJPharmAnal2008,28(10)
HPLC法测定维生素BT的有关物质
程奇蕾,余振喜,张启明
(中国药品生物制品检定所,北京100050)
摘要目的:建立高效液相色谱法测定维生素BT的有关物质,并利用LC—MS对其
中的有关物质进行分析.方法:色谱柱:
ZORBAXNH1柱(150mill×4.6mlTl,5'Lm),流动相:磷酸盐缓冲液(6.81g?L磷酸二
氢钾溶液,0.2tool?L氢氧化钠溶液
调pH至4.7)一乙腈(35:65),流速:1mL?rain'.,检测波长:205BITI.结果:样品中维生素
BT峰与杂质分离良好;最低检测
限为0.125g.初步鉴定了维生素BT杂质A的结构,并采用维生素BT与其杂质A
的分离度作为色谱系统的保证.结论:所
建立的方法简便,快速,可准确地分离测定维生素BT原料药中的有关物质.
关键词:高效液相色谱法;维生素BT;有关物质
中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254—1793(2008)10—1709—03
H=PLCdeterminationofrelatedsubstancesofvitaminBT CHENGQi—lei,YUZhen—xi,ZHANGQi—ming
AbstractObjective:ToestablishanHPLCmethodforthedeterminationoftherelatedsubstan
cesofvitaminBT
andtoanalyzetherelatedsubstancesbyLC—
MS.Methods:ThechromatographiccolumnwasZORBAXNH,(150 mmx4.6mm,5m),themobilephaseconsistedofphosphatebuffer(6.81g?Lpotassiumdihydr
ogenphosphate
adiustedtopH4.7with0.2mol?Lsodiumhydroxidesolution)一
acetonitrile(35:65),theflowratewas1mL?
min,,detectionwavelengthwas205nm.Results:VitaminBTwasseparatedwithitsimpuriti
esthoroughly;theLOD
was0.125gforvitaminBT.StructureofimpurityAwasidentifiedbyESI—
MS.ResolutionofvitaminBTanditsim—
purityAwasusedforsystemsuitabilitytest.Conclusion:Themethodwassimple,rapid,specif
icandaccurate.
Keywords:HPLC;vitaminBT;relatedsubstances
维生素BT为3一羧酸一2一羟基一?,,,?一三 甲基一1一丙铵盐酸盐,为维生素类药,其分子式为 C7H15NO?HC1.经检索,TheMerckIndex收载了 本品,其CAS号为461—05—2.主要用于治疗消化 功能失调所致的腹胀,嗳气,恶心以及胃灼热,包括 老年性,妊娠以及小儿的消化不良.国家食品药品 监督管理局国家药品
收载了本品原料药及其片 剂的质量标准0J,两标准中均未收载有关物质检 查方法,维生素BT片标准收载了HPLC含量测定方 法.美国药典3O版和英国药典2007年版收载 了本品游离碱的手性异构体左卡尼汀(1evocarni. tine),其分子式为CHNO.USP30版未收载左
卡尼汀的HPLC方法,BP2007年版中采用HPLC法 检查左卡尼汀的有关物质.本文用维生素BT片国 通讯作者Tel:(010)67095301;E—mail:zqmbj@hotmail.con
家药品标准的HPLC含量测定方法(方法1)和英国 药典2007年版左卡尼汀有关物质检查方法(方法 2)分别测定维生素BT原料的有关物质,与方法2 测定的结果比较,方法1会漏检1个较大的杂质. 且由于本品有关物质长期没有控制,检验的几批国 内样品均有不同程度的质量问题.因此,本文参考 方法2的条件,建立了高效液相色谱法测定维生素 BT的有关物质,该法操作简便,快速,结果准确,可
靠.
1仪器与试药
高效液相色谱仪(日本岛津),包括Lc一
10ATvp泵,SPD一10A二极管阵列检测器,Class— VP色谱工作站.WatersAcquity?UPLC,Quattro PremierXEQQQ液质联用仪.维生素BT对照品由 药物分析杂志ChinJPharmAnal2008,28(10)
Sigma提供,批号:01/99,纯度99.3%.维生素BT 及其杂质A的混合物由企业B提供,归一化法测定 含量,维生素BT为92.0%,杂质A为13.9%.乙 腈为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯. 2方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1系统适用性试验溶液取维生素BT及其 杂质A的混合物约50mg,置10mL量瓶中,加流动 相溶解并稀释至刻度,即得.
2.1.2对照品溶液取维生素BT对照品约50ITlg, 置10mL量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,即得. 2.1.3对照溶液精密量取对照品溶液1mL,置 100mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,即得. 2.1.4供试品溶液取维生素BT约50mg,置l0 mL量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,即得. 2.2色谱条件采用ZORBAXNH2(150mm×4.6 mm,5p,m)色谱柱,流动相为磷酸盐缓冲液(6.81g ?
L磷酸二氢钾溶液,0.2tool?L氢氧化钠溶液 调pH至4.7)一乙腈(35:65),流速1mL?min,, 检测波长为205nm,进样量25.此条件下典型 的色谱图见图1.
1
图1维生素BT与杂质A的色谱图
Fig1HPLCehromatogramofvitaminBTandimpurityA
1.维生素BT(vitaminBT)2.杂质A(impurityA)3.未知杂质1 (unknownimpurity1)4.未知杂质2(unknownimpurity2)
2.3方法专属性
2.3.1维生素BT与其杂质A的分离取系统适
用性试验溶液,按"2.2"项下色谱条件测定,结果
明维生素BT与其杂质A能很好的分离,分离度为 2.0(图1).
2.3.2破坏试验取本品约50mg,置10mL量瓶
中,分别加0.1tool?L盐酸,0.1tool?L氢氧化
钠溶液以及30%过氧化氢溶液各2mL,加酸或碱中 和后,加流动相溶解并稀释至刻度;另取本品约50 mg,置10mL量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度, 分别于80?水浴中加热6h和4000lx光照24h. 按"2.2"项下色谱条件测定上述溶液.结果表明, 在上述条件下,所破坏出的杂质均能与维生素BT 较好地分离,说明该方法专属性良好,见图2.其 中,在强酸,强碱和氧化破坏条件下,维生素BT出 现明显降解,在加热及光照条件下,维生素BT峰面 积略有下降.
图2酸破坏(1),碱破坏(2),氧化破坏(3),热破坏(4)及光破坏 (5)的色谱图
Fig2ChromatogramsofsamplesdestroyedbyHC1(1),destroyedby
NaOH(2),destroyedbyH202(3),destroyedbyheat(4)anddestroyed
understronglight(5)
2.4检测限和定量限取对照品溶液,用流动相逐 级稀释,精密量取25进样,分别按l0倍和3倍
信噪比计算维生素BT的定量限和最低检测限,维
生素BT的定量限和最低检测限分别为0.4g和
0.125Ixg.
2.5精密度取对照溶液,按"2.2"项下色谱条件
测定,重复进样5次,维生素BT峰面积的RSD为
0.45%.
2.6稳定性取同一份供试品溶液,按"2.2"项下
色谱条件测定,分别于0,2,4,6,8h进样分析,维生
素BT峰面积的RSD为0.2%,杂质A峰面积的
RSD为1.5%,总杂质峰面积的RSD为0.2%.供
试品溶液在8h内稳定性良好.
2.7样品有关物质测定精密量取对照品溶液,供
试品溶液和对照溶液各25L注入液相色谱仪,按
"2.2"项下色谱条件测定,记录色谱图至维生素BT 主成分峰保留时间的3倍.供试品溶液的色谱图中 如显杂质峰,量取各杂质峰面积之和,分别采用自身 对照法计算,结果见表1和图3.
表1有关物质的检测结果(%)
TablResultsofrelatedsubstances 药物分析杂志ChinJPharmAnal2008,28(10) 3
图3有关物质色谱图
Fig3Chromatogramsofrelatedsubstances
1.维生素BT(vitaminBT)2.杂质A(impurityA)3.未知杂质1 (unknownimpurity1)4.未知杂质2(unknownimpurity2)
A.批号(LotNo.)20030106B.批号(tNo.)104070705 3讨论
3.-维生素BT及其主要杂质均为末端吸收,因此述 择205nm检测.检出的杂质紫外吸收与维生素BT 基本一致,因而采用不加校正因子的自身对照法检
查维生素BT的有关物质(图4).
_删
B
?^/
图4维生素BT及其杂质的紫外吸收光谱 Fig4UVspectraofVitaminBTanditsimpurities
3.2本文收集的2个厂家,共4批原料及1批对照 品采用"2.2"项下色谱条件测定,有4批可检出维 生素BT杂质A.采用ZORBAXNH,柱(150mm× 4.6mm,5Ixm),IntersilNH2(250mm×4.6inn,5 m)和CapcellpakNH2((150mm×4.6mm,5m) 色谱柱,主峰与杂质A的分离度在1.3,3.1,表明 该色谱条件耐用性较好.鉴于主峰与杂质A分离 度较小,本文引入系统适用性试验溶液,以两者的分 离度作为系统的保证.
3.3针对原料中的有关物质,采用LC—MS联用技 术对有关物质的结构进行了初步推断,色谱条件为 ZORBAXNH,(150mln×4.6mm,5m)色谱柱,流 动相为10mmol?L乙酸铵缓冲液(pH3.2)一乙 腈(40:60),质谱条件为:采用正离子电离(ESI)方 式,毛细管电压:3.0kV,锥孑L电压:30V,脱溶剂气: 350L?h,,锥孔气:50L?h,,源温:105cC,脱溶 剂温度:350?.从一级全扫描质谱图中获得杂质 A的准分子离子峰[M+1]为m/:143.6,与BP 2007年版中所列的杂质A相符,
H3c,一
一
.
H3cbH
1
一
—6
H3C
II
图5维生素BT(I)及杂质A(?)结构
Fig5Thestruclut'eofvitanfinBT(1)anditsimpuritiesA(?) 3.4实验中另外参考维生素BT片国家药品标准 的HPLC含量测定方法检查本品的有关物质,色谱 条件为C.柱,磷酸盐缓冲液(pH2.4)一甲醇(98: 2)为流动相,检测波长215nm.UitimateAQ—C. (250film×4.6111113,5Ixm),DiamonsilCl8(250mm× 4.6mm,5Ixm)和ZORBAXSB—C均不能将维生 素BT与杂质A分离,而UltimateXB—C(250am ×4.6nlm,5txm)可以将维生素BT与其杂质A分 离.表明该方法用于检查维生素BT的有关物质耐 用性较差,不适于作为国家药品标准方法,该色谱条 件用于片剂的含量测定方法也存在专属性较差的问 题,有待修订.
参考文献
1DrugSpecificationsPromulgatedbySFDA(闷家药品监督管理局药 品标准).Vol5(第五册).2002.226 2DrugSpecificationsPromulgatedbySFDA(国家药品监督管理局药 品标准).Vol5(第五册).2002.228 3USP.30.2460
4BP2007.1287
5TheMerckIndex.T0URTEENTHEDITION:301
(本文于2008年6月12?修改fn])