美国、欧洲、日本和中国药典中家兔热原检测法的主要差异及分析

美国、欧洲、日本和中国药典中家兔热原检测法的主要差异及 美国、欧洲、日本和中国药典中家兔热原检 测法的主要差异及分析 药物分析杂志ChinJPharmAnal2008,28(12) 美国,欧洲,日本和中国药典中家兔热原检测法的主要差异及分析 谭德讲,杜颖,张潇,李冠民 (中国药品生物制品检定所,北京100050) 摘要:对美国,欧洲,日本和中国药典的现行版关于家兔热原检测法的主要差异进行了汇总比较.结合多年的实际工作经验, 分析了这些差异对热原检测的影响,并对中国药典的今后改版提出了6点建议. 关键词:药典;家兔;热原检测法 中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254—1793(2008)12—2149—07 Disscussionofthemajordifferencesofpyrogen testbetweenUSP,EP,JPandChP TANDe—jiang,DUYing,ZHANGXiao,LIGuan—min (NationalInstitutefortheControlofPhm’maceuticalandBiologicalProducts,Beijing100050,China) Abstracts:ThemajordifferencesofpyrogentestbetweenUSP,EP,JPandCHPin—usearecompared.Th eeffectof thedifferencestothePyrogentestisdiscussedaccordingtopersonalexperienceand6suggestionsarebrin gedfor? wardtofurtherrevisioninCHP. Keywords:Pharmacopoeia;Rabbits;Pyrogentest 热原检测是保证非肠道用药(parenteralmedi— cines)安全的重要之一.自1942年美国药典 第?版(USPXII)收载家兔热原检测法后,随着该类 制品品种的逐步增多,各国药典纷纷收载了此方法, 并(曾经)把此方法做为热原检测的一个”金标准”. 此法在最初仅仅以3只家兔升温超过0.6oC的只数 做为判定标准?J,但由于在使用中出现的问题,科 技条件的发展和对制品安全性的提高,各国药 典都在逐步改进实验的各个步骤,以至今天各国药 典收载的方法中有诸多不同之处. 本文将欧洲,美国,日本和我国的现行药典在家 兔热原实验方面各个环节的不同进行了汇总比较, 并就其差异进行分析,讨论.在2010版药典修订之 际,通过横向比较,吸收各国药典之长,并对其发展, 修改历史进行研究,不仅可为我国药典的修订提供 参考,同时还可减少人力,财力的浪费. 1各国药典中家兔热原检测法的主要区别 作者收集了现行的欧洲药典2008年第六版 (EP6),美国药典(USP30)和日本药典(JPXV)三 个主要国家的药典英文版本与我国的现行药典二部 第一作者Tel:(010)67095789;E—mail:tandj@nicpbp.org.en (CHP2005)进行比较.由于日本药典2001年的? V版与现行XV版差异较大,将其一并列人表1中 进行对比,以便显示药典修改的一些趋向. 2对四国药典之间差异的比较分析 2.1动物要求各国药典都规定”使用健康成年 家兔,雌雄兼用”.从美国药典关于热原实验的各 版本发展看(没限制体重也能基本控制热原),对使 用动物的过多限制,可以使热原实验结果更可靠,但 浪费了大量可用的实验动物. 2.2适应期根据本实验室的实验数据,新进人的 家兔在实验室适应9d时,筛选率明显高于7天以 下.故若为提高筛选合格率和热原实验的准确性, 驯养适应期表述为在7d以上为佳. 2.3对实验环境的规定各国药典对家兔饲养环 境温度的要求以美国的最为严格,中国最为宽松. 由于室温对家兔热原实验特别是对筛选率有显着影 响,故确定热原实验在20,25cC下进行为最佳; 同时,热原实验期问的温差波动应该明确规定?3 c【=.这与我国国标对屏障动物实验设施的要求是一 致的.对于湿度,只有美国药典给出了明确表述. 一 2150,药物分析杂志ChinJPharmAnal2008,28(12) 表1EP,USP,JP与ChP关于家兔热原检测法实验中的主要差异 Tab1ThemajordifferencesofthePyrogentestbetweenEP,USP.JPandChP 药物分析杂志ChinJPharmAnal2008,28(12)一2151一 家对热原检测合 兔格的家兔间隔 重时间要求(the 复intervaldemand 实fornexttestof 验rabbitsafterthe 要first~mpletest 求ispassed) (““对热原检测不 合格家兔的使 pea用要求(Festin— usetervaldemand0f ol rabbitsfornext rab1))tafterthetest ~mpleisfailed) 永不使用家兔 的判定标准 (Criteriafordis— cardlherabbits1 热家兔正常体温 原的确定方法 实ffb0dfor出一 验terariningthe 步controltxaly 骤tenlp) 区 别 fdifie一 所用家兔正常 体温范围(nor- mallx~lytern— peratureiu3iige) 每只兔注射前 =;omin内温差 fthedifferenee ofthebody temp.between30 nfinbefoietest injection) 组内家兔基础 体温差要求(de— mandforthe ditIerellcesof n0nbody temp.beb,veen thetlu’eerabbits lno/ielrlleCtlon group ?48h 不能再用 (notusean) 若检品检测为热原超标, 该组内的所有家兔永不再 使用(ifthetestsampleis failed,allthe3rabbitsarc discard) 在给药前的45min内测 两次体温,间隔为3omin, 取两次的平均值(正常体 温)(usetheffleal3ofthe tworecordsbetween30min in45minbeforeinjection of~mple) ?3d 至少休息3周方可使用 (restatleastfor3weeks beforenextuseforpyrogen test) 当用于热原检测的3只家 兔平均升温值>12?( themeandiffereneeofeach 【HHIvtemp.in3rabbitsis >1.2?.allthe3rabbits shouldbedi~ard) 基本同中国药典,取问隔 30min的两次体温平均值 (aninitia1)(SAllleas ChP) 38.O,39.6?=;8.O一398? ?O2oC?n2? ?1? 给药时限(injec一?15min tionperiod) ?1? ?48h没有该项表述/>48h (nOexpression) 休息两周以可以使用没有该项表述 (restatleastfor2weeks(noexpression) beforenextuseforpyro— gentest) 没有规定不能使用 (noexpression) 没有明确给出确定方法 (noExpression) ?398?,无下限要求 (nolowlimit) 没有明确表述 (nOexpression) ?1? 没有该项表述 (1lOexpression) 每1h测3次体温,第2 次与第3次体温近似 时,选第3次体温(一 cordthreethnesin1h beforeinjection.Usethe lastrecordascontrol tempifthesecondre— con]isneartothelast one) <39.8?.无下限要求 (nolowlimit) 不能使用 (notuseagain) 同前项 fthesameas】ast 【em) 在给药前的4omin 内测两次体温,间隔 为30rain,取两次的 平均值(正常体温) fusetheineallofthe tworecords1)etween 3ominin45minbe— J『einjectionofsam- pie) ?38?,无下限要 求(DOlowlimit) 没有明确表述?n2.C (nOexpression) 没有明确表述 (BOexpression) ?l2arin(除非有特殊规?3omin(每只不超过15n 定,一般每只注射时间?410min)(?10minfor mln)(general?4minforinjectionofeachrabbit) injectionofeachrabbitilll— lessthereisspecialde— man(]) 没有明确表述 (nOexpression) 表述同USP(ex— pres.-~xtinthesame wayasUSP) 一 2152一药物分析杂志ChinJPharmAnal2008,28(12) 目前还没有专门论述湿度对热原实验结果的影响的 文献发表,我们实验室将近2年来的湿度变化对 家兔脚皮炎发生率的影响进行了统计分析,同时对 有脚皮炎家兔与正常家兔的热原筛选实验合格率进 行了统计分析,发现湿度过高,显着增加了普通家兔 (我国的热原实验家兔均为普通级)的脚皮炎发生 药物分析杂志ChinJPharmAnal2008,28(12) 率,而有脚皮炎家兔的筛选合格率显着低于正常家 兔的筛选合格率.所以,考虑到我国的国情,为优化 家兔热原实验,建议药典中应该对热原实验时的环 境湿度进行相对明确的规定,如”符合动物实验设 施的国标要求”或直接说明”湿度范围应在30%, 70%的范围”等. 2.4家兔热原实验使用的保定方式,即对固定装置 的要求热原实验时对家兔的固定方式也对家兔的 体温有影响.身体呈固定方式和呈自然状态方式进 行体温测定各有优缺点:身体固定方式可减少动物 因受惊吓引起骚动而导致探头脱落,但检测到的体 温低于呈自然状态下家兔的体温,使筛选合格率降 低,特别是在冬季.呈自然状态的家兔必须保证不 受外界惊吓,否则家兔挣扎严重,体温波动大(这是 热原实验技术要求应避免发生的现象),但该种方 式更符合动物习性和福利要求,应该提倡.美国药 典在早期版本中也只描述为以适当方式固定,后来 才明确表达.故作者认为改用明确表达为”头部固 定,身体呈自然状态站立”的表述为佳. 2.5对测温探头插入深度的要求各国药典对测 温探头的插入深度表述各不相同,根据实际工作经 验,家兔在测温的4h内会有挣扎,排便等现象,如 果插入过浅,很易脱落,使体温的测定出现偏差.为 了实验的准确性,”插入7.5CITI左右”的表述更切 合实际操作.这样,即使在实验过程中探头有外移, 也不易脱落,不会影响到体温测定.因此建议将插 入深度改为7.5em左右. 2.6筛选实验的要求 2.6.1对于新家兔,在驯养适应1周以上后,必须 在热原实验前的一定时间内进行筛选实验.从表中 可见,美国药典的要求最宽松,7d之内即可.从实 际工作考虑,间隔一定时间后,可以消除筛选实验对 动物造成的应激影响,但即使在筛选后第一天进行 热原实验,也只会降低合格率,增加实验重复的概 率,不会增加药品的不安全性.所以作者认为美国 药典的表述可以接受(即实验前7d内进行筛选实 验). 2.6.2对于已经进行过热原实验的家兔,若长期不 用,再次使用时,也应进行筛选实验.对于该项内容 的表述判定,没有查到数据支持.根据家兔生长的 情况看,我国使用家兔体重在1.7,3kg之间,一般 都使用2kg以上的家兔.在这种体重条件下,体温 变化较小,规定”3周未使用”做为启动筛选实验的 标准没有较大影响.但从今后国际接轨的角度看, 若对动物体重不做特别说明时,采用欧洲药典的表 述方式更好些. 2.6.3不能使用的家兔中国规定体温在39.6? 以上的家兔不能使用,比其他3国药典中的规定降 低0.2?,未见有科学依据.除规定体温上限条件 外,美国和日本药典没有其他规定家兔不能使用. 但欧洲和中国药典还规定了家兔体温低于38.0oC 的家兔也不能使用.从已有的工作经验看J,当家 兔基础体温从39.8?依次下降时,其在筛选和实验 过程中的体温波动逐渐增大,实验时造成的复试或 不合格率的概率依次增高(实际上对控制产品质量 更严格).故美国药典没有规定家兔基础体温下 限.有关筛选实验中应注意的一些事项,作者对其 中的一些因素已经进行了专门讨论,这里不在赘 述. 2.7热原实验步骤中家兔正常体温和最大升温值 确定方法的区别 中国,欧洲药典和最新的日本药典均明确给出 相同的家兔正常体温和最大升温确定方法,该表述 方法可以继续使用,但这种方式最好在采用结果判 定与欧洲相一致的方式,即不以单只家兔升温来判 定热原是否超标.这是因为(A):注射可造成的家 兔行为异常(受惊,骚动挣扎)可导致家兔体温的升 高,从而对实验结果产生干扰作用,尤其是单只升 温,很易超过0.5oC以上;(B):制品本身如肿瘤坏 死因子等细胞因子本身具有致热作用,且该类制品 的热原检测最高升温点都在30rain达到高峰,将注 射后的30rain点计入其中,很易造成热原检测不合 格现象,而实际这种不合格并非外源性热原超标造 成,而是制品自身发热所致.故在注重单只升温的 测定方法(美国药典)中,只记录1—3h内的升温 值,而将注射后的30rain点不计人其中,忽略由于 注射等人为因素造成的升温,这是比较科学的.欧 洲和最新版日本药典不考虑单只升温,仅以升温总 和计算,对于这种判定方法,即使记录注射后的半小 时升温,也对最后结果产生的影响较小.我国药典 要求记录注射后30min点,同时在结果判定时注重 单只升温,这种情况使得初试实验中出现复试或不 合格的概率显着增大,往往使结论出现偏颇(这可 能也是日本药典2006年版中改用了与欧洲相同的 结果判定方式的原因).故建议在该项检测方法中 若采用欧洲的结果判定方式,可以记录注射后30 min的点;否则,按照美国药典的判定方式时,最好 不记录注射后的30min温度点. 药物分析杂志ChinJPharmAnal2008,28(12) 2.8热原实验结果判定方面的区别 在2006年以前,对家兔热原检测法的结果判定 有3种方式,即欧洲药典的只计组内家兔升温总和 方式,日本药典的只计单只升温判定方式和美国与 中国药典的上述两种方式的组合方式(既考虑单只 升温超标,也计组内升温总和).2006年以后,13本 药典对其家兔热原方法进行了巨大的修改,基本引 用了欧洲的判定方式.故现在对热原结果的判定基 本只有两种方式. 中国药典虽然在实验方法上与欧洲相同,但在 结果判定上,基本采用美国药典的判定方式,只是标 准比美国的要宽松一些(以0.6?为升温超标判定 标准,8只家兔升温总和以3.5qC为区分标准).中 国药典在实验方法上与欧洲相同,而结果判定上与 美国药典一致的做法,也许正是目前出现较多重复 现象的原因1 2005年,SebastianHoffmann等人对制品是否 受热原污染的实验结论与所使用的法规判定标准进 行了研究,发现之间有很大关系.当内毒素浓度是 7.38EU?kg时,这时可造成家兔升温平均值达到 0.6?,所有各药典的计算法都可达到发生热原反 应的概率至少达到95%.但是,如果阈值定在2.53 EU?kg,,升温到0.41?,那么发生热原反应的概 率在EP中是2.5%,在USP中是53.8%(这使得结 果很难准确判定). SebastianHoffmann等研究者在其论文中也从 3R和全球统一的角度提出了两个数学模拟的结果 判定模式.在该模式中,每次只用2只家兔,共三次 即可得出结论;其中的A适合于EP和JP,而B 方案适合于美国药典.该两模式,仅用6只家兔,没 有改变现各国药典的判定标准,在现代药品生产技 术(符合GMP)下,可以节省大量的实验动物. 由上可见,在日本药典2006年XV修改后,采 用了与欧洲药典一致的判定结果,即不以单只升温, 而是以升温总和计的方式,并考虑到动物福利和3R 要求,这样对实验者可以简便,准确地判定结果,同 时也减少了重复和不确定性.作者认为对我国药典 今后的修订有一定方向性启发. 3对新版中国药典修改的几点建议 通过上面的比较及分析,作者在此提出我国药 典下版的修订中,应该注意修改的一些方面;由于仅 是作者的个人观点,难免出现偏颇之处,仅供同行专 家批评参考. 3.1对于热原实验的一些非原则问题,可以放宽要 求,但对于原则问题,一定要严格限定.这一点在美 国药典体现的比较充分,如只限定家兔正常体温的 上限,对下限不做规定,如果使用低体温家兔,会出 现更多的复试或不合格现象(假阳性),降低了合格 率,但并不会影响药品的安全性.而美国药典对家 兔升温的超标阈值是最严格的,从原来的0.6,下 降到0.5?.8只家兔的升温总和从3.7?下降到 3.3qC,这样可以更好地保护广大的患者利益,加强 药品的安全性. 3.2将现代科技发展对动物实验的新要求(特别 是3R,动物福利)充分体现在药典方法中:如将家兔 的固定方式明确为颈部固定,身体保持自然状态就 是动物福利的一个很好体现,但同时对实验者的技 术提出更高的要求.减少家兔的使用更是今后的一 个发展方向.作者对于SebastianHoffmann等研究 者的新模式持坚定支持态度.日本药典在2006年 的第XV版中,将药典中家兔热原检测法进行了全 面改版,几乎在接受欧洲药典思想的同时,将现代的 3R概念引人其中,通过9只家兔来最终判定实验结 果(比欧洲药典的方法减少3只家兔).这是很值 得我国药典在下次改版中充分考虑借鉴的. 3.3中国药典的一,二,三部应统一使用1种家兔 热原检测方法.而不是各部不同.纵观各国药 典,只有中国药典在不同部中有独自的热原检测法. 在此呼吁不同领域的热原工作专家能在主管部门的 协调下,统一为1个标准方法. 3.4家兔热原法本身不是定量检测,作者认为无论 使用那种标准,其最终目的就是保证人民的用药安 全,同时便于实验者准确判定结果和尽量减少实验 成本.所以作者建议专家充分研究,借鉴欧洲药典 的方法或现日本药典的方法.欧洲药典的家兔热原 检测法已经使用50年,没有发生重大临床问题.日 本的最新改版充分考虑了欧洲的标准,在标准不变 (单只升温不超过0.55oC)的情况下使用9只家兔 完成整个实验过程.采用欧洲药典的结果判定模 式,可以很好地与国际接轨,也为今后的全球通用标 准做准备. 从美国药典的历史发展看,在家兔热原法建立 之初,从1942年的XII版第1次收载热原检查法 至1955年前的第?V版,这3个版本也是以单只家 兔的升温做为判定热原是否超标的标准(与日本药 典2001年?V版一致).到1955年的第XV版提 出若3只家兔的升温均>10.6?或3只家兔升温总 和超过2.1?,可直接判定制品不合格,在该版中也 药物分析杂志ChinJPharmAnal2008,28(12) 提出了8只家兔有?4只出现升温为0.6oC,或8 只的升温总和超过3.7?时为不合格.直到1995 年版才基本改为现标准. 美国药典现判定标准比中国更为严格,如果我 国采用美国药典标准,会提高热原检测标准,加强了 药品安全性,但可能因普通家兔及实验条件等造成 更大的检测成本. 3.5建议采用小数点后两位记录法.我们知 道,一般数位的确定是在精确数位后多加1位来读 取,最后以四舍五人的方式确定最终结果.该方式 在有后续运算时,更应该采用,以免误差传递过程中 发生积累,造成更大的误差.现我国药典中两步实 验中均有合计(1.4c【=为复试判定标准,3.5?为不 合格判定标准),已经规定测温探头的精度为0.1, 所以采用温度显示为0.01的分辨力,即采用保留两 位小数进行读取并计算,比只保留一位小数的数据 采集方法更好.欧洲药典一直这样使用. 3.6应重视热原检测新方法的研究,家兔实验法的 不是检测热原的”金标准”:家兔法是以哺乳动物 的发热机理进行热原检测,可检测大部分对人致热 的物质;过去一直被认为是检测热原的”黄金标准” (GoldenStandard),但在新制品不断增多的今天,尤 其是在对生物制品和在生物技术基础上产生的细胞 治疗技术,组织学,人工器官和新生物材料以及 中药注射剂等制品,对于其内的高分子抗原或半抗 原类物质,因家兔与人的种属差异,能否完全代表人 体的发热反应还是个疑问;该法对病毒的检测到目 前为止结论模棱两可,至少已经肯定对流感病毒不 能检测,同时,已经发现通过家兔热原检测的制品在 临床上还发生热原反应.由此可见,家兔热原 检测法的局限性在现代药品检测中越来越明显,迫 切需要发展新的更有效的热原检测方法.目前,国 际上正在研究的IPT法就是以取代家兔热原实验法 的一个很好方向,希望国内专家能关注该方法并积 极投人其中的研究评估中. 参考文献 1USP(J947)XIII,Pp679—680;USP(1950)XIVPp744—745 2TANDe—jiang(谭德讲),DUYing(杜颖),ZHANGHe—zhan(张 河战),eta1.Theeffectsoftheshamtestontheresultofrabbitpyro— gentest(家兔热原实验中预检温对实验结果的影响).Chinn (中国约事),2005,19(1):25,28 3DUYing(杜颖),LIXiu—ji(李秀记),TANDej—iang(谭德讲). 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