丙型肝炎病毒(HCV)核酸扩增(PCR)
荧光定量检测标准操作程序
一、目的:明确丙肝病毒核酸定量检测的操作规程,指导检验人员正确进行丙肝病毒核酸定量的检测,保证检测结果及时可靠。
二、范围:适用于进行丙肝病毒核酸定量检测的检验人员。
三、职责:实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
四、检测原理:本试剂盒从血清或血浆中提取HCV RNA,在逆转录酶作用下将RNA逆转录为HCV cDNA,在引物的指导下,以四种脱氧核苷酸为底物,通过耐热DNA聚合酶的酶促作用,对cDNA进行体外扩增,用Taqman探针法检测扩增产物。通过标准曲线,即可计算出被检物的含量。
五、试剂:
1. 来源:上海科华生物
股份有限公司HCV核酸扩增荧光定量检测试剂盒〔国药准字S20040063〕。
2. 规格:32人份/盒。
3. 试剂盒组成:
3.1 病毒RNA提取试剂:用于从血清或血浆中提取HCV RNA。
裂解液 4ml×1瓶 含有硫氰酸胍的溶液
助沉剂 1瓶 含有助沉剂的冻干粉末
去抑制剂 1瓶 含有去抑制剂的冻干粉末
洗涤液A 14ml×1瓶 含有硫氰酸胍的溶液
洗涤液B 4ml×1瓶 含有Tris的溶液
洗脱液 1.8ml×2支 含0.04% NaN3的灭菌双蒸水(无RNase)
核酸提取柱 32支×1包 含连接套管
3.2 核酸扩增(PCR)― 荧光检测试剂:
RT―PCR试剂
PCR主反应液 250ul×1支 含有一对引物和dNTP的溶液
酶混合物 180ul×1支 含有Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂的溶液
荧光探针 20ul×1支 含有荧光探针的溶液
对照品
阴性对照 250ul×1支 含有0.05% NaN3的HCV RNA阴性的混和人血清
强阳性对照 250ul×1支 含有约2×106 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA
弱阳性对照 250ul×1支 含有约2×104 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA
工作标准品① 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA
工作标准品② 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA
工作标准品③ 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA
工作标准品④ 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA
工作标准品①~④的参数和强、弱阳性对照的定值允许范围根据批号不同而不同。详见试剂盒的说明书附页。
六、仪器:Roche LightCycler
七、操作程序
1、
处理(标本处理区进行)
标本处理(所有操作需采用无RNA酶的带滤芯吸嘴及离心管,在标本处理区进行)
1.1试验前准备
1.1.1将裂解液置70℃加热5分钟,使试剂瓶内的结晶全部溶解。吸取1ml裂解液加到助沉剂的试剂瓶中,用吸嘴搅动,混匀后全部吸回到裂解液瓶中,混匀后备用。
1.1.2 在去抑制剂的试剂瓶中加入700ul洗脱液,用吸嘴搅动,溶解后混匀备用。
1.1.3 在洗涤液A的瓶子中加入6ml无水乙醇,颠倒混匀后备用。
1.1.4 在洗涤液B的瓶子中加入16ml无水乙醇,颠倒混匀后备用。
1.2 病毒RNA提取
1.2.1取n个0.5ml离心管(n=标本数量+阴性对照、强阳性对照、弱阳性对照和4个工作标准品),做好标记后分别加入100ul已混有助沉剂的裂解液。
1.2.2分别用带滤芯吸嘴加入100 ul需处理的血清或血浆标本和对照品,用带滤芯吸嘴反复吹打5次。
1.2.3 再分别用带滤芯吸嘴加入20 ul 去抑制剂,盖上管盖,振荡混匀,离心数秒,置70℃反应10分钟。
1.2.4 离心数秒,用带滤芯吸嘴加入110ul无水乙醇,振荡混匀,离心数秒。
1.2.5 将做好标记的核酸提取柱插入连接管后,固定在负压装置上,将步骤2.4中的所有液体小心移入核酸提取柱。注意不要将液体溅入其它样品的核酸提取柱内。
1.2.6 开启负压,让核酸提取柱内的液体全部抽干。
1.2.7 在每个核酸提取柱内加入500ul洗涤液A,开启负压,让核酸提取柱内的液体全部抽干。
1.2.8 在每个核酸提取柱内加入500ul洗涤液B,开启负压,让核酸提取柱内的液体全部抽干。
1.2.9从连接套管上取下核酸提取柱,将其放入无RNA 酶的2ml离心管中,盖上管盖,14000rpm离心1分钟。
1.2.10将提取柱放入一新的2ml离心管中(确保采用无RNA酶的离心管),小心将50ul洗脱液加在柱面中央,静置1分钟。
1.2.11盖上管盖,10000rpm离心1分钟,取2ml离心管中的收集液12.5ul 做PCR反应
。
2、RT―PCR试剂准备(PCR前准备区进行)
从试剂盒中取出PCR主反应液、酶混合物和荧光探针,室温下融化后离心数秒,按照待扩增标本数量X ,取PCR主反应液:酶混合物:荧光探针=7∶5∶0.5混合,加入一适当体积离心管中,充分混匀后离心数秒,分装至PCR毛细反应管中,每管12.5ul,将装有PCR反应液的毛细反应管转移至标本处理区。
3、加样(标本处理区进行)
3.1 在装有PCR反应液的毛细反应管中用带滤芯吸嘴分别加入12 .5ul已处理好的标本(标本处理步骤2.11离心管中的洗脱液)。
3.2 盖上管盖,离心数秒后转移至扩增检测区。
4、PCR扩增(扩增检测区进行)
4.1 将毛细反应管放入LightCycler荧光PCR扩增仪进行扩增检测。
4.2 样品设置
在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型及工作标准品参数(见试剂盒内提示)。
4.3荧光检测通道:F1
4.4循环参数设定:
Program
Cycles
Temperature
Target(℃)
Hold Time
(min:sec)
Slope
(℃/sec)
Acquisition
Mode
1
1
50
25:00
20
None
2
1
94
2:00
20
None
3
5
93
3
20
None
55
15
2
None
72
15
20
None
4
42
93
3
20
None
60
45
20
Single
5
1
40
30
20
None
5、结果
5.1 选F1或F1/F2通道,点击Quantification按钮,进入数据分析界面。
5.2 在数据分析窗口中,将噪音线Noise Band的位置移至刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点,且CT值不出现任何数值为准(可根据仪器本身的实际情况加以调整),得到各标本的HCV RNA检测结果。
6、质控标准
6.1 本试剂盒的定量线性范围:103≤测定结果≤107IU/ml。
6.1 工作标准品标准曲线的相关系数| r |≥0.950。
6.2 阴性对照的测定结果为0(结果不显示任何值)。
6.3 强、弱阳性对照的定量结果在试剂盒提示的规定允许范围内。
7.结果判断
本试剂盒的检测灵敏度为500IU/ml,定量测定范围为103~107IU/ml。
7.1 定性结果判断:
7.1.1测定结果为0(无数值)的标本为HCV RNA阴性标本。
7.1.2 测定结果≥500IU/ml的标本为HCV RNA阳性标本。
7.2 定量结果判断:
7.2.1对于103≤测定结果≤107 IU/ml的样本,提示本次测定结果在试剂盒有效定量检测线性范围内。
上注明其测定结果。
7.2.2对于测定结果>107 IU/ml的样本,提示病毒含量高于试剂盒定量检测线性范围上限,所测结果仅供参考,报告上注明>107 IU/ml。若需精确定量,可根据所测结果,将该标本用阴性血清稀释至104~106 IU/ml后复测。
7.2.3对于500≤测定结果≤103 IU/ml的样本,提示病毒含量低于试剂盒定量检测线性范围下限,所测结果仅供参考,报告上注明<103 IU/ml,建议随访。
7.2.4测定结果为0(无数值)的标本为HCV RNA阴性标本。
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