中性粒细胞碱性磷酸酶中性粒细胞碱性磷酸酶
( N-ALP NAP)
碱性磷酸酶包括一组在PH中性以上能够从很多醇和酚的单磷酸酯释放出碱的同功酶。 一(正常分布:
人体血液与造血细胞的碱性磷酸酶活性,主要存在于中性粒细胞系统的成熟阶段中,其他成分如嗜酸、嗜碱、淋巴、单核以及巨核细胞,血小板,浆细胞等均为阴性反应,网状内皮细胞和巨嗜细胞的反应为强阳性。
二(生理变化:
1(年龄变化:新生儿ALP极高,随后下降,成人较儿童期减低,老年期(>6)最低。 2(性别差异:无差别,但也有报道女>男。
3(季节变化:夏季为高。
4(应激状态下的变化...
中性粒细胞碱性磷酸酶
( N-ALP NAP)
碱性磷酸酶包括一组在PH中性以上能够从很多醇和酚的单磷酸酯释放出碱的同功酶。 一(正常分布:
人体血液与造血细胞的碱性磷酸酶活性,主要存在于中性粒细胞系统的成熟阶段中,其他成分如嗜酸、嗜碱、淋巴、单核以及巨核细胞,血小板,浆细胞等均为阴性反应,网状内皮细胞和巨嗜细胞的反应为强阳性。
二(生理变化:
1(年龄变化:新生儿ALP极高,随后下降,成人较儿童期减低,老年期(>6)最低。 2(性别差异:无差别,但也有报道女>男。
3(季节变化:夏季为高。
4(应激状态下的变化:紧张、恐惧、休克、激烈运动等。
5(妊娠期的变化:妊娠2~3个月时。NAP轻度高。以后逐月趋于显著。 6(与激素的关系:肾上腺皮质激素,雌激素和ACTH都有使NAP活性升高,有人认为
ACTH的作用是通过肾上腺皮质而发生的。
三(临床意义:
1(重度增高:
类白血病反应:NAP活性极度增高与CML鉴别。
感染:细菌感染的NAP改变比较明显,其中,NAP活性高度增高者见于各种急性化
脓性感染(如败血症、大叶性肺炎、化脓性脑膜炎等)。
2(中度增高:
感染:见于支气管肺炎、肾盂肾炎。
贫血:AA。
非AL性骨髓增生性疾患:PV、骨髓纤维化、CML合并骨髓硬化症、持发性ITP、
AL:ALL。
恶性淋巴瘤:何杰金氏淋巴瘤。
3(轻度增高:
感染:上呼吸道感染、肺结核等。网状细胞增高,遗传性低NAP症。
AL:MM、神经母细胞瘤。
贫血:溶血性贫血。
4(降低:
贫血:镰形细胞贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿。
AL:CML显著减低
感染:病毒性感染、特别是病毒性肺炎。
5(正常或无规律:急粒的NAP活性可减低也可正常。并发感染时可有中度升高。当治疗
后充分缓解时,有些NAP活性可恢复正常。单核细胞改变缺乏的规律性,绿色瘤和
M6与急粒相似。
网状细胞肉瘤多数病例增高,少数在正常范围内。
淋巴肉瘤可增高,可正常。MDS可增高、正常和减低。
主要鉴别:
1(CML—类白 2(PNH—AA 3(ALL—ANLL 4(PV—反应性PV 5(细菌升高—病毒(特别是肺炎)
四(染色方法:
碱性磷酸酶是一种能分解磷酸酯的水解酶,方法不同,原理不同。国际标准化委员会提
出。推荐的方法应该是快速,简便,容易重复,并有很宽的技术范围。
方法:(1)钙—钴法
(2)未取代萘酚法:底物а—磷酸萘酚钠。
(3)取代萘酚法:国际标准委员会推荐两种方法:
A( 1963年Kaplow 等:萘AS-BI磷酸盐
B( 1963年Tomonaga等:萘AS-MX磷酸盐
国际标准化委员会认为а—萘磷酸盐产生的反应产物。生色团不好,并且是水溶性的,因此使用这种基质的方法是不满意的,只有考虑应用那些萘磷酸的代用品。适当耦联物的选择是基于从技术观点看耦联物的特性,及它们是否容易获得,这两个方面。萘AS-BI磷酸盐,结果快。萘AS-MX磷酸盐,因为它耗费时间,除日本外其它国家很少了解,但它对白细胞中酶染色的质量是比较好的。其它细胞化学反应的技术因素,如固定pH范围,温浴时间,温浴介质的缓冲作用等也应予以考虑。国外大都应用萘酚AS-BI磷酸。
上海儿研所对三种白细胞碱性磷酸酶染色方法的评价,认为(1)钙钴法平均阳性指数最低仅2.12。虽有人主张延长孵育时间以提高阳性率和阳性指数,但由于孵育时间长,易使阳性产物扩散;且钙—钴法的基质液的配制较麻烦,影响其结果的因素很多。(2)未取代萘酚法虽然反应时间缩短,阳性指数正常值相对较为稳定,但基质液不能长期保存,每次需临时配制孵育液。(3)取代萘酚法较其它方法有以下特点,酶活性显示较充分,正常值68%以上可以显示LAP活性,阳性指数均值较其它方法高,反应酶的钝化与丢失较少,阳性产物色泽鲜明,溶解度低,不扩散,因而定位精确,有利于评定ALP活性强度的分级,例三者平均值。
一 NAP三种试验方法比较
钙—钴法 未取代萘酚法 取代萘酚法
组 别 阳性率% 阳性指数 阳性率% 阳性指数 阳性率% 阳性指数
X?SD X?SD (平均)(平均)范围 X 范围 X+SD 范围 X 范围 范围 X 范围 (平均)(平均)(平均)(平均) 高阳性指数组 35-81 68 66-254 210?13.5 40-76 70 45.8-154 101?17 85-100 93 347-540 450.3?5 (N=24)
正常阳性指数组 20-39 34 41-82 62?18 17-40.5 26 18-69.8 49.5?20 68-99 84.1 164-380 240.2?56.2 (N=60) 低阳性指数组 10-40 29 12-84 57?20 6-55 40 6-70 40?28 40-80 61 24-396 186?38 (N=22)
染色方法介绍:
一 钙-钴法:
(一)原理:磷酸酶能水解各种磷酸有机盐,并释放出磷酸,组化方法是利用被释放出来
2+ 磷酸与Ca结合,成为磷酸钙而沉淀下来,再与硝酸钴与硫化铵作用。生成黑色的
硫化钴。
(二)试剂
1(孵育液:3% β-甘油磷酸钠 10ml 2% 巴比妥钠 30ml
2% Ca(NO) 20ml 2% mgsO 2ml 324
混匀,以0.5NaoH调pH至9.3-9.4置5’后即可。
2(2%巴比妥钠
3(1%硫化铵
4(0.5%伊红
5(0.5%美兰
(三)步骤:
DW1g DW冲 干 干 冲 B 95%乙醇 孵育液 2%硝酸钴 1%硫化铵5’ 0.5%伊红 0.5%美兰 镜检
固定10’ 37?6h 干 5’ 干 冲 冲 干
(四)正常值: 阳性率 阳性指数
B 53.7% 81.9?6.4
BM 49.2% 84.7?9.8
此方法阳性率低,时间长,稳定性差,影响因素多,现基本不在采用。 二 偶氮染料法:萘AS-MX磷酸盐
(一)原理:底物在pH 9.5被WBC中酶水解产生磷酸和芳基萘胺,芳香萘胺再与偶氮偶联,
形成不溶性染料。
(二)试剂:
萘酚AS-MX磷酸钠盐(sigma)
固兰RR 冰醋酸 α-氨基-2-甲基1,3丙二醇 N,N-二甲基甲酰胺
甲醛 甲醇 藏红花红O
a(固定剂:取10ml甲醛和0.01ml冰醋酸,加入到90ml甲醇中充分混匀,保存在冰箱、
冰盒中备用。
b(贮存缓冲液(0.2M PH 8.6丙二醇)
取2.1gα-氨基-2-甲基1,3丙二醇溶于4ml N,N-二甲基甲酰胺中,再向此溶液中,
加入76ml贮存缓冲液和120ml DW,混匀放4?冰箱,备用。
C(作用液:贮存底物溶液 20ml 固兰RR 20mg 充分混匀,用前迅速过滤。
d(复染液:0.5% 藏红花红O。
(三)步骤:
水冲 水冲
B 固定剂 作用液 复染液
5’’ 干 2h 干
(四)结果:酶活性呈现为不连续的分散的兰色颗粒,在人中性粒细胞胞浆中,细胞浆染
成浅红色,很少的淋巴细胞可呈现很弱的反应,其它细胞无反应。 (五)分级标准:
(-)无燃料颗粒。
(+)5个燃料颗粒以内。
(++)5个以上到30个可以清楚计数的颗粒。
(+++)30个以上呈不同均匀分布的颗粒。
(++++)30个颗粒以上分布不均匀,颗粒之间可以清楚辨别。
(+++++)中性粒细胞胞浆内充满于颗粒,且颗粒之间不可清楚辨别。 (六)正常值:阳性率>68% 阳性指数164-380
上海儿研所80年进行观察:
(一)不同重氮盐的显示效果。从分解速度,产物色泽和无解来说以坚牢兰RR所得结果最
好。
重氮盐名称 抑 制 分 解 色 泽 沉淀类型
坚牢紫B + + 综 红 颗 粒
坚牢兰BS ++ -,+ 综 黑 明显扩散
坚牢兰B ++ + 蓝 黑 清度扩散
坚牢兰RR + -,+ 浓 蓝 颗 粒
(二)不同孵育时间对LAP活性的影响从表3中可见孵育2-4h反应最充分,所以选用2h。
(三)不同浓度坚牢兰盐RR对显示结果的影响。表4
坚牢兰盐RR浓度 例 数 阳 性 指 数
(mg/ml) 范 围 均 值
3 8 53-87 71.4
2 8 160-180 172.1
1 8 181-246 205.4
0.5 8 161-270 221.0
0.25 8 141-189 170.1
浓度在0.5-1mg/ml时,LAP活性显示最充分,沉淀物也不扩散。 (四)不同浓度萘酚AS-MX对结果的影响。表5
阳 性 指 数
例号 10mg 7mg 5mg 4mg 2mg
1 154 222 210 220 54
2 52 62 60 50 19
3 333 438 466 443 72
4 380 455 442 450 140
5 58 44 60 52 33
6 162 180 197 193 102
7 206 200 221 166 104
8 170 174 216 222 74
9 114 136 145 166 90
10 188 177 172 92 76
100 94 30 11 86 79
随底物不断增高,阳性率在>4mg以上并无明显变化。 七(注意事项
1(重氮盐和底物保存4?冰箱,避免与皮肤接触或吸入。 2(一般用B比BM片好,在细胞分布比较均匀的部位进行计数,三日内计数,否则防入低
温冰箱(可放半年左右)。
3(各地区应有各地区的正常值。
三
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