类脂质蛋白沉积症一家系的基因突变检测

类脂质蛋白沉积症一家系的基因突变检测 中华皮肤杂志2005旦鲞第1— 类脂质蛋白沉积症一家系的基因突变检测 王昌媛章平肇张福仁刘杰田洪青余龙 【摘要】目的研究类脂质蛋白沉积症一家系的细胞外基质蛋白l(ECM1)基因突变. 采用 DNA双向测序法直接检测类脂质蛋沉积症一家系中患者及其父母,同胞,子女的 ECMI基因.结果直 接测序检测m本家系新的突变位点,患者为遗传复合体,ECM1的两个等位基因分 别存在错义突变 (C220G)和无义突变(R476X).在50个正常汉族人的ECM1基因中未发现有突变. 患者父亲为突变 C220G的携带者,而母亲为突变R476X的携带者,患者的子女,同胞及同胞子女中 大部分为突变C220G 或R476X的携带者.结论本类脂质蛋f1沉积症家系存在新的ECMl基因突变位点. 【关键词】类脂蛋白累积病;细胞外基质蛋白质类;突变 ECM1GeneMutationsinaFamilywithLipoidProteinosisWA,vGChang-3UO/Z*,ZM,vG Ping-zhao. ZHANGFu— ren,LIUj,TlANHong-qing,YULong.*ShandongProvincialInstituteofDermatologyand Venereology,Jino.n250022,China 【Abstract】 ObjectiveTostudymutationsintheextracellularmatrixprotein1(ECM1)geneinafamily withlipoidproteinosis(LP).MethodsBi— directionalDNAsequencingwasusedtodetecttheECM1genein patientswithLPaswellasamongtheirparents,siblingsandchildren.ResulIsSequencingfro mthe"affected individualsrevealedanewcompoundheterozygoteofmissense/nonsensemutations.C220 G/R476X.whichwere notfoundinthecontro1group.ThefatherwasacarrierofthemissensemutationC220Gandthe motherwasa carrierofthenonsensemutationR476X,bothononeallele.Theothersiblings,thepatientschil drenandtheir siblings'chihtrenwerecarriersofeitherC220GorR476Xmutations.ConclusionAnewcomp oundhet— erozygousmutationofECM1genewasidentifiedinthisLPfamilv. 【Keywords】Lip(】idprI)teinosis;Extracellularmatrixproteins;Mutation 类脂质蛋白沉积症(1ipoidproteinosis)(OMIM 247100)是一种罕见的常染色体隐性遗传病.自 Urbach和Wiethe于1929年首次描述该病以来. 世界上共报告了250多例患者.本病的主要临床 现为声音嘶哑,眼睑串珠状半透明丘疹,皮肤黏膜 浸润增厚,脱发,牙齿发育不良,复发陛腮腺炎等,部 分患者因颞叶或海马的钙化灶而产生癫痫等一系列 神经精神症状.分子遗传学研究表明类脂质蛋白沉 积症是由位于染色体lq21的细胞外基质蛋白1 (extracellularmatrixprotein1,ECM1)基因突变所 致l3].目前,在不同的类脂质蛋白沉积症家系中共检 测出约20个不同的突变位点,一般每个家系都拥有 自己独特的突变位点.只有1个突变位点(507delT) 发生在3个不同的家系中l1.引.本研究通过DNA双 向测序法对一类脂质蛋白沉积症家系的ECM1基因 进行了检测,探讨本家系基因突变的特点. 基金项目:山东省科技攻关基金资助项日(032103107) 作者单位:250022济南,lh东省皮肤病性病防治研究所(王昌 媛,张福,田洪青);复且大学遗传工程国家重点实验室(章平肇,刘 杰,余龙) 仁.E一通讯作者:张福,nail:zhanIgfuren@hotmail.coin 与方法 659 ? 论着? 1.临床资料:为在我院确诊的一类脂质蛋白沉 积症家系.详细资料见文献『5]. 2.外周血基因组DNA的制备:经患者知情同 意后,取患者及其父母,同胞,子女的外周血各 6mL,2%EDTA抗凝.按改良的酚,氯仿抽提方法 提取其基因组DNA.正常对照取自复旦大学遗传工 程国家重点实验室保存的50份正常汉族人基因组 DNA样品. 3.ECMI基因11个外显子的PCR扩增及PCR 产物提纯:9对引物分别位于其相应的内含子(表1. 由上海博亚生物技术有限公司合成),其中外显子2/ 3,4/5,5a的引物为我们自行设计的.余者均按文献 [6]设计.采用25L的PCR反应体系,其中包括 10×PCR缓冲液2.5IxL(含20nmolMgC12);基因组 DNA模板1IxL,10m0儿上游引物及下游引物各 0,5IxL,10mmol/LdNTP0.5IxL,TaqDNA聚合酶 0.5IxL(0,5U),补足双蒸水至25L,于PE9600基 因扩增仪中进行PCR反应.反应条件为首先95? 预变性5min,之后35个循环.每个循环包括:95? 华皮肤科杂志2005年11箜鲞筮L塑 表1PCR扩增ECM1基冈所~JW,J9对引物 变性45S.60?复性45S.72?延伸45S.反应结束 后用2%琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物.最后用 PCR提纯试剂盒将PCR产物提纯., 4.DNA测序:纯化的PCR产物在进行测序反 应后.经ABI377基凶自动测序仪进行正向测序,对 怀疑有突变的外显子再进行反向测序予以证实. 结果 1.PCR扩增:利用9对引物将ECM1基因的11 个外显子扩增来,并用琼脂糖凝胶电泳检验其 DNA片段大小.均与预计相同. 2.检测}fJ本家系新的基因突变位点:对患者的 PCR产物纯化后直接测序.发现患者为遗传复合 体.ECM1的两个等位基分别存在不同的突变位 点(与基因库及最新的文献对比.均为新的突变).其 中错义突变是ECM1基因的外显子6的第220密码 子TGC为GGC代替,导致正常的半胱氨酸(C)突变 为甘氨酸(G),即C220G.无义突变是外显子10的 第476密码子CGA为TGA代替.即正常的精氨酸 突变为终止密码子.导致蛋白翻译的提前结束.即 R476X.所有突变位点均南反向测序证实.在50个 正常汉族人的ECM1基因中未发现有相同突变.患 者父亲为突变C220G的携带者.而母亲为突变 R476X的携带者.患者子女,同胞及同胞子女中大 部分为突变C220G或R476X的携带者(图1). 讨论 尽管在1969年Gordon等就发现类脂质蛋白沉 积症为常染色体隐l生遗传病.其病因一直未得到明 确.直到2002年.Hamada等通过对不同国家的6个 类脂质蛋白沉积症家系进行基因连锁.首先将 本病定位于染色体lq21的一段2-3cM的范围内. 并进一步证明致病基因为ECM1基因ECM1是一 种分泌糖蛋白,目前其功能并不十分明确.可能与表 A B C ChinJDermatn],November2005,Vol38,No11 正常对照(eXOlll0) C220G(TGC--*GGC)R476X(CGA---*TGA) TTCcc'cN'CI'CC^C??TCCCN?^C?T^AC^ i?先证者(exon6)先证者(exon10) C220G(TGC—+GGC)R476X(CGA—TGA) TcCC'C'cT'cC^c55TcccN5AC'T^^c ?先证者之父(exon6)让者之母(exon10) 图1正常人先证者及其父母ECM1基因的测序结果A.正 常对照.B左图示突变C220G,658位核苷酸T突变成G:行图示突 变R476X,1426位核苷酸c突变成T.c左图示患者父亲携带突变 C220G:右图示患者母亲携带突变R476X 皮细胞分化,真表皮连接,血管内皮细胞增生及骨的 形成等有关_7=.它的特点为含有典型的CC一(X7—10) 一 C结构.这种结构还存在于血清白蛋白中,可形成 双环.在蛋白与蛋白的连接上起重要作用l8l.最近的 一 项研究表明.ECM1与一种基底膜蛋白聚糖 perlecan相互作用.而perlecan又与纤连蛋白,层黏 蛋白,?型胶原,血小板生长因子7及成纤维细胞生 长因子等真皮中重要的蛋白相互作用I91.因此推测 ECM1的减少或缺失将导致这些蛋白功能的紊乱. 真皮结构发生异常而发病.而本家系的突变位点 C220G即为最靠近5端的CC一(X7—10)一C结构中 的半胱氨酸突变成甘氨酸.而突变R476X则导致最 靠近3端的CC一(X7—10)一C结构丧失.因此这两个 突变均严重影响ECM1连接其他蛋白的功能.并通 过后续的一系列机制导致类脂质蛋白沉积症的临床 表现.而且ECM1共有3个不同的剪切体.这两个突 变分别位于外显子6和10.从而影响了ECM1的所 有剪切体,导致患者临床表现严重. 以往的研究表明,类脂质蛋白沉积症的突变大 部分集中在ECM1的外显子6和7上,一般不同的 家系突变位点不同,我们的研究也进一步证实了这 个观点,发现了本类脂质蛋白沉积症家系新的突变 位点.在已发现的突变位点中绝大多数是纯合子,只 有两个是遗传复合体,本类脂质蛋白沉积症家系中 患者亦为遗传复合体.我们推测遗传复合体也是常 见的,尤其是在非近亲结婚的类脂质蛋白沉积症家 系中.本研究通过DNA直接测序成功检测到此类脂 质蛋白沉积症家系新的基因突变.并发现家系中患 堕,2—00—5q-11Jl备鲞疆11~]一ChinJ—Dermatol,No—vem—ber—200—5,— Vol—38—,N—o 者及同胞的子女多为其中一种突变的携带者,我们 将根据情况为其提供婚娴及生育方面的遗传咨询, 这是我们本次研究最直接的意义. 参考文献 1UrbachE.Wlethe(:.1ipoidosiscutiset/flU(?osae.VirehowsArch (Pathn1Aoat).1929273:285—319 2HamadaT.1.ipnidproteim)sis.ClinExpDtrmato1.2002.27:624— 629. 3Hamada1.MeLear~WH.RamsavM.eta1.1.ipoidproteinnsismaps tnIq2Iant1iScauserII1vmutationsintheextracellularmatrixpro— tein1gene(ECM1).HumM01Genet.2002.11:833—840. 4ChanI.BingewarG.1atilK.eta1.AnlndianIlhildwithlipoidprn— teinnsisresultingfrontal-e(?urrentframeshiftnmtation(507delT)in 661 theextraeellularmatrixproteinlgene.BrJDermato1.2004.15l: 726—727. 5王昌媛.张福f?.中国5家系类脂蛋白沉积症临床和遗传特点分 析.中国麻风皮肤病杂志,2005,2l:96—98. 6HamadaT.WessagowitV.SnuthAP,eta1.Extracellularmatrixpro— teinlgene(ECM1)mutationsinlipoidproteinosisandgenotype— phenotypecorrelation.JInvestDermatol,2003,l20:345—350. 7ChanI.Fheroleofextracellularmatrixproteinlinhumanskin. ClinExpDermatol,2004.29:52-56. 8SmitsP,NiJ,FengP,eta1.Thehumanextracellularmatrixgenel (ECM1):genomicstructure,cDNAcloning,expressionpattern,and chromosomallocalization.Genomics.1997.45:487—495. 9MongiatM,FuJ,OldershawR,eta1.Perlecanproteincoreinteracts withextraeellularmatrixproteinl(ECM1),aglycoproteininvolved inboneformationandangiogenesis.JBiolChem,2003,278: l749l—l7499. (收稿13期:2004—12-30) ? 广告目次? 兰美抒0乳膏(盐酸特比萘芬乳 膏)…………………………………………………………中美天津史克制药有限公 司 美能0(复方忖革酸注射液,复方'酸苷片)…………………………………………… 深圳市健安医药公司总经销 两安杨森与中国皮肤科事,共成长………………………………………………………………西安杨森制药有限公司 阿维A胶囊……………………………………………………………………………………重庆华邦制药股份有限公司 孚琪0(联苯l廿唑乳膏)…………………………………………………………………北京四环医药科技股份有限公司 泰尔丝0(异维A酸胶几)…………………………………………………………………上海信谊培菲康医药有限公司 适今可(砒硫翁锌气雾 剂)………………………………………………………………广东精优惠南医药有限公司经销 嘉瑞(盐酸布替萘芬乳 膏)…………………………………………………………………山东正大福瑞达制药有限公司 地恒赛0(地氯雷他定 片)…………………………………………………………………………丽珠集团丽威公司经销 艾洛松0(糠酸莫米松乳 膏)…………………………………………………………………上海先灵葆雅制药有限公司 兰美抒(盐酸特比萘芬 片)………………………………………………………………………北京诺华制药有限公司 理肤泉痘痘清净化修护 霜…………………………………………………………………………欧莱雅(中国)有限公司 理肤泉每日隔离乳 液………………………………………………………………………………欧莱雅(中国)有限公司 思可得0(复方硝酸溶 液)………………………………………………………………………山东德美克制药有限公司 明欣利迪(咪喹英特乳 膏)……………………………………………………………………四川明欣药业有限责任公司 布特(氟芬那酸丁酯软 膏)…………………………………………………………………………同联集团沈阳抗生素厂 彼赛宁0(氯雷他定 片)………………………………………………………………………浙江京新药业股份有限公司 企业形 象…………………………………………………………………………………………重庆华邦制药股份有限公司 企业形 象…………………………………………………………………………………………重庆华邦制药股份有限公司 卓青0(注射川盐酸大观霭 素)………………………………………………………………山东鲁抗医药股份有限公司 环利(环吡酮胺软 膏)………………………………………………………………………………北京双吉制药有限公司 澳能0(肉米松乳 膏)……………………………………………………………………………香港澳美制药厂有限公司 紫外线光疗 仪…………………………………………………………………………………上海希格玛高技术有限公司 露得清 0(Neutrogena)…………………………………………………………………………………强生(q-国)有限公司 雅漾舒护活泉水…………………………………………………………………法国皮尔法伯雅漾护肤化妆品研制公司 普特彼.(他克莫司软 膏)………………………………………………………………………藤泽药品(q-国)有限公司 IPL0QUANTUMHR/sR强脉冲治疗 仪……………………………………………………………科医人医疗激光公司 蔓迪(米诺地尔 酊)…………………………………………………………………………………浙江万马药业有限公司 迪苏0(卡介菌多糖,核酸注射液)…………………………………………………………………浙江万马药业有限公司 海飞丝 0………………………………………………………………………………………………宝洁(中国)有限公司 摩弥齐(糠酸荧米松乳 膏)……………………………………………………………………上海通用药业股份有限公司 复方青黛胶 囊…………………………………………………………………………………陕西天宁制药有限责任公司 德国WahhnannUV紫外比皮肤病治疗 仪……………………………………………………北京康联医用设备有限公司 2007年中华医学会一欧莱稚中国人健康皮肤,毛发研究项目……………………………………………………………… 医用液氮 枪…………………………………………………………………………………哈尔滨雪贝低温仪器有限公司 lIIIl?23456789O?23456789O?23456789O?2牡牡抽枷钏牝抓扣棚扣蜘物韧棚棚,,,,,,,,,广广广广广广广广广广广广广广广广广广广广广广广