嗅成鞘细胞移植对AD大鼠脑内COX活性和线粒体超微结构的影响.doc

嗅成鞘细胞移植对AD大鼠脑内COX活性和线粒体超微结构的影响.doc 嗅成鞘细胞移植对AD大鼠脑内COX活性 和线粒体超微结构的影响 作者:姚柏春 孙天敏 王金勇 李勇 王配军 李文春 【摘要】 目的 探讨嗅成鞘细胞(OECs)移植对阿尔茨海默病(AD) 大鼠脑内COX活性和线粒体超微结构的影响。 SD大鼠双侧海 马注射Aβ1,40，建立AD大鼠模型。实验动物分为四组:正常对 照组、AD模型组、OECs移植组、人工脑脊液(MCSF)注射组，每 组12只。体外原代培养OECs并将其移植至AD大鼠双侧海马。运 用行为学测试、组织化学、原位杂交结合图像分析以及电镜等技术 和工具，观察、比较各组大鼠学习记忆能力、海马CA1区线粒体细 胞色素氧化酶(COX)活性、细胞色素氧化酶?型亚基(CO ?)mRNA表达，以及CA1区神经元线粒体超微结构等指标的变 化。结果 与正常对照组比较，AD模型组大鼠空间学习记忆能力、 海马CA1区线粒体COX活性及CO?mRNA表达明显降低 (P<0.05)，线粒体数量减少，结构不清、肿胀、空泡样变、嵴断 裂;OECs移植明显上调上述指标(P<0.05)，并对线粒体超微结构 有明显的保护作用。结论 OECs移植通过改善AD大鼠学习记忆能 力、提高海马COX活性和CO?mRNA表达以及保护线粒体等作 用，对大鼠AD具有明显的治疗效果。 【关键词】 阿尔茨海默病;细胞色素氧化酶;线粒体;嗅成鞘细 胞;移植 【Abstract】Objective To observe the effect of olfactory ensheathing cells (OECs) transplantation on cytochrome oxidase (COX) and the ultrastructure of hippocampal neurons mitochondrion in A1zheimer′s disease (AD) rats. Methods AD model was established by Aβ1,40 injected into hippocampus CA1. The rats were randomly divided into normal control, model, OECs transplantation and the manpower cerebral spinal fluid (MCSF) injected groups. There were 12 rats each group. OECs were cultured in vitro and injected into AD rat′s hippocampus. The ability of learning and memory was verified by the performance of Morris water maze task. The activity of COX in rat′s hippocampus CA1 was detected with the method of enzyme histochemical staining coupled with computer image analysis system. The expression of CO?mRNA was observed by in situ hybridizajtion. Ultrastructural changes of neuron mitochondrion in rat′s hippocampus CA1 were viewed under transmisson electron microscope. Results Compared with the normal control group, the learning and memory ability of Aβ injected rats were lower, the number and ultrastructure of hippocampus neuron mitochrondrion had distinct change, the activity of COX and the expression of CO?mRNA in hippocampus CA1 of the animals model of AD had been markly declined. OECs transplantation could improve above indexes. Conclusions The efficacy of OECs on AD maybe partly result from improving the abilities of spatial 1earning memory, the activities of COX, the expression of CO? mRNA and protecting hippocampus neuron mitochrondrion. 【Key words】Alzheimer′s disease; Cytochrome oxidase; Mitochondrion; Olfactory ensheathing cells; Transplantation 阿尔茨海默病(AD)的发病机制与神经元中的线粒体能量代谢 障碍关系密切〔1〕;而细胞色素氧化酶(COX)又是线粒体呼吸链的 关键酶，其活性下降可直接干扰呼吸链的电子传递，进而影响神经 细胞的能量代谢〔2〕。目前临床对AD治疗的药物虽能够减轻AD 的症状，但对海马神经元线粒体超微结构与COX活性改善不够理想 〔1，2〕。嗅成鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)是具有增 殖分化能力并在中枢神经系统和周围神经系统均能促进轴突再生、 激活内源性干细胞的胶质细胞;主要应用于脊髓损伤、脑损伤等神 经离断损伤中神经轴突的修复。新近有学者研究发现OECs移植对 AD等神经退行性病变有一定的效果，因而OECs移植被视为可解决 这一矛盾的治疗策略之一〔3，4〕。为此，本实验观察OECs移植 对AD大鼠脑内COX活性和线粒体超微结构的影响，探讨OECs移 植对大鼠AD的治疗效果。 1 材料与方法 1.1 实验动物与主要试剂 健康雄性Sprage Dawley(SD)大鼠48只，SPF级，3,4月 龄，体重210,260 g，由本院实验动物中心〔许可证号: SCXK(鄂)2005 0008〕提供。人工脑脊液(manpower cerebral spinal fluid，MCSF)(mmol/L)组成:NaCl 124.0(7.254 g)，KCl 3.0(0.223 5 g)，MgSO4?7H2O 1.0(0.246 g)，KH2PO4 1.2(0.163 2 g)，葡萄糖 10.0(1.8 g)，NaHCO3 25.0(2.1 g)，CaCl2 1.0(0.111 g)，pH 7.2,7.4。 通过Morris水迷宫筛选实验动物，去除先天痴呆(潜伏期平均值 >50 s)和游泳姿势不良者;将合格大鼠48只随机分为四组:正 常对照组、AD模型组、OECs移植组、MCSF注射组，每组12 只。 1.2 建立大鼠AD模型 将大鼠β淀粉样蛋白1,40(Aβ1,40)溶于无菌生理盐水(5 μg/ml)，放入37?温箱孵育2 w，使其变成丝状聚集状态。用35 g/L 的戊巴比妥钠(35 g/kg)将大鼠麻醉后，按包新民等〔4〕编著大鼠 脑立体定位图谱、用江湾 I型C通用立体定向器定位:(AP 3.5 mm，ML?2.0 mm，DV2.7 mm)即为海马注射点。双侧海马注射2 μl(10 μg)Aβ1,40，10 min内注完，并留针10 min。单笼饲养至大鼠完全清醒，肌肉注射青霉素。Aβ1,40海马注射后第7周用Morris水迷宫检测，若大鼠学习记忆能力明显减退，随机从其中抽取10,经Nissl染色、6E10免疫组织化学、刚果红组织学染色，出现神经细胞减少、Aβ斑和老年斑(SP)，则该批大鼠确定为AD模型成功鼠(本实验室既往工作)〔3,8〕。随机抽取AD模型成功鼠36只分为AD模型组、OECs移植组、MCSF注射组，每组12只。 1.3 OECs培养 OECs的分离培养参照文献〔9〕，从成年SD大鼠嗅球取材，进行OECs原代培养。选用2.5个月龄SD大鼠(由郧阳医学院实验动物中心提供)，取嗅球，去除其表面毛细血管，顺嗅球长轴方向夹碎嗅球，保留富含OECs的嗅神经层及嗅球颗粒层。胰蛋白酶消化后，用体积分数为20%的胎牛血清的DF12培养基，将其制成1×106/ml单细胞悬液，接种于未涂胶的底面积为25 cm2的斜口塑料培养瓶中，利用差异贴壁法进行纯化培养，低亲和力神经生长因子受体蛋白免疫组化染色鉴定OECs。用质量浓度为10 μg/ml的Hoechst33342标记OECs，制成单细胞悬液，细胞浓度为50 000个/μl。 1.4 OECs海马内移植 将AD模型成功鼠在实验动物中心继续普食喂养3 w，即Aβ1,40海马注射4 w后，用于下一步实验。用35 g/L的戊巴比妥钠(35 g/kg)将大鼠麻醉后，按包新民等〔5〕编著大鼠脑立体定位图谱、用江湾 I型C通用立体定向器定位:(AP 3.5 mm，ML?2.0 mm，DV2.7 mm)即为大鼠海马移植点。OECs移植组双侧海马内各注射20 μl OECs，速度为1 μl/min，20 min内注完，并留针10 min。MCSF注射组双侧海马内各注射20 μl MCSF，骨蜡封闭颅骨，缝合头皮。单笼饲养至大鼠完全清醒，肌肉注射青霉素，密切观察实验动物4 w。 1.5 Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力 ?定位航行实验:历时5 d，从第1天起，每天分上、下午各训练1次。训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，让大鼠寻找、游向并爬上平台，记录其潜伏期、运行时间;每次训练时间为120 s。如果大鼠在120 s内未找到平台，须将其引至平台;这时潜伏期记为120 s，并记录其错误次数1次;每次训练后让其在平台上停留15 s。?空间搜索实验:在第6天撤除水下平台，随机选取一入水点，在同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录其在120 s内跨过原平台相应位置的次数和第一次通过平台的时间。 1.6 标本制作 于OECs海马内移植后第28天。 1.6.1 COX组织化学染色 参照Crockett法，将大鼠麻醉后打开胸腔，经左心室、升主动脉快速灌注200 ml生理盐水(右心耳切开)洗净血液，然后灌注0.1 mol/L PB配制的10 g,L多聚甲醛?25 g,L戊二醛400 ml进行固定。1 h后取脑，后固定2 h，放入150，200，300 g,L蔗糖磷酸盐缓冲液，梯度脱水，隔夜沉底。OCT包埋后入-70?冷丙酮速冻，移至-28?恒冷箱切片机平衡温度后连续冠状切片，片厚6 μm。切片在37?下湿盒中孵育，孵育液组成为DAB 40 mg、细胞色素C 20 mg、蔗糖1.4 g、过氧化氢酶2 mg、PB 20 ml。1 h后用PBS冲洗终止反应。常规酒精脱水、透明、封片。 1.6.2 原位杂交法检测CO?mRNA表达 经大鼠左心室灌注固定(4%多聚甲醛，0.1 mol/L磷酸缓冲液，pH 7.2)。剥取大脑，按常规固定、脱水，冰冻切片，切片厚30 μm。以地高辛标记寡核苷酸 5′ GCTCTTCTATAATAGGGGATGTGGCGTCTT 3′作探针，按照博士德试剂盒说明书操作，DAB显色并进行图像分析，计算阳性细胞数和平均吸光度。1.6.3 电镜观察 将大鼠麻醉、灌注、固定后取脑并进行后固定1 h。分离海马CA1区，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，Reichert Jung超薄切片机切片，醋酸铀、枸橼酸铅染色，H 600型透射电镜观察、摄片。对每个标本在海马CA1区注射针孔周围随机选取两张铜网观察，每只铜网在细胞质区域拍照两张，照片放大20 000倍。 1.7 统计学分析 数据均用x?s表示，应用SPSS12.0统计软件包进行组间均数t检验。 2 结果 2.1 OECs存活和迁移 移植OECs后28 d，OECs移植组大鼠的大脑组织切片中有大量圆形的荧光物质，而并非弥散于组织间，这说明植入体内的OECs存活数量较多。移植的OECs沿胼胝体分别向两侧海马区及其周围皮质迁移。 2.2 各组大鼠学习记忆能力的变化 Aβ1,40海马注射第28天，AD模型组潜伏期明显延长、过平台次数明显减少，与正常对照组潜伏期有显著差异(P<0.05)，OECs移植组、MCSF注射组潜伏期、过平台次数与AD模型组接近(P>0.05);OECs海马内注射第28天，OECs移植组潜伏期明显缩 短、过平台次数明显增加，与AD模型组潜伏期有显著差异(P<0.05)，接近正常对照组(P>0.05)。见表1。表1 各组大鼠Morris水迷宫试验潜伏期与过平台次数(略) 2.3 COX活性变化 采用MD 20图像系统软件分析所摄图片，得到的灰度平均值分别为正常对照组0.93?0.17，AD模型组0.42?0.04，OECs移植组0.83?0.13，MCSF注射组0.41?0.05(图1)。AD模型组在针道周围COX组织化学染色比正常对照组显著减弱，其灰度值也明显下降，即AD模型组大鼠海马CA,区线粒体COX活性显著低于正常对照组(P<0.05);而OECs移植组染色比AD模型组显著增强，其灰度值也明显升高，即OECs移植组大鼠海马CA,区线粒体COX活性显著高于AD模型组(P<0.05)。 2.4 线粒体的超微结构变化 在电镜下，海马CA1区的锥体神经元胞质中，正常对照组、OECs移植组线粒体数目多，结构清晰;而AD模型组、MCSF注射组线粒体数量明显变少，结构不清，出现了明显的肿胀，空泡样变化，嵴断裂(图2)。图1 COX组织化学染色示各组大鼠海马CA1区COX的活性变化(×10)图2 电镜观察各组大鼠海马神经元线粒体超微结构变化(×20 000) 2.5 CO ?mRNA 表达变化 AD模型组大鼠海马CA1区CO? mRNA表达的阳性细胞数和平均吸光度显著低于正常对照组(P<0.05);而OECs移植组明显高于AD模型组、MCSF注射组(P<0.05)。见表2。表2 各组大鼠海马CO?mRNA表达(略) 3 讨论 细胞外存在大量由β 淀粉样蛋白(Aβ)组成的老年斑(SP)是AD的主要神经病理特征之一。大量Aβ一方面引起神经元线粒体结构和功能受损〔10〕，使丙酮酸脱氢酶活性下降，糖的氧化功能发生障碍，乙酰胆碱生成不足，进而影响胆碱能神经元功能;另一方面大量Aβ还可氧化损伤线粒体DNA结构，使其编码的呼吸链复合物酶蛋白亚基表达下降，影响酶的活性及能量代谢。因此，减少或抑制Aβ的产生，逆转或保护神经元线粒体结构和功能是 AD治疗的核心环节之一。 本实验提示AD模型大鼠脑能量代谢出现一定程度的障碍;OECs移植能显著提高AD大鼠海马COX活性，表明OECs移植可以提高呼吸链关键酶 COX活性，改善AD大鼠能量代谢障碍〔11〕。本文提示OECs移植可能通过促进CO?mRNA表达量，以提高AD大鼠脑线粒体COX水平，来改善能量代谢。OECs移植能明显稳定和保护AD大鼠海马细胞线粒体的超微结构。 本实验结果表明，OECs移植能够提高AD大鼠空间学习记忆能力，提高AD鼠大脑海马线粒体COX活性及其CO?mRNA表达作用，稳定和保护AD大鼠海马细胞线粒体的超微结构。其可能机制〔12〕是:?OECs分泌的神经生长因子与神经元表达的相应受体结合，?OECs膜表面黏附分子的作用，?OECs的成鞘作用，?OECs的迁移性，?OECs抑制胶质增生，促进神经元存活，促进神经元轴突再生，促进神经干细胞(NSCs)形成新生神经元;从而减少或抑制Aβ的产生，保护神经元线粒体结构和功能，改善AD大鼠的空间学习记忆能力。OECs移植为AD治疗提供了新的前景〔13〕。 【