土壤DNA提取方法汇总

碱液加热煮沸法(Direct Cellular Lysis/Protein Extraction Protocol for Soil) 1、称取3g(可根据实际情况,按比例增减土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),装于50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入37℃预热的10mlDNA提取液(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl, 2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V],6mg/ml溶菌酶)(1 2) 2、漩涡振荡混匀,然后再37℃下水浴40min,水浴期间,每隔10分钟左右,混匀样品; 3、水浴结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,160ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴1.5h,每隔20min上下颠倒混匀一次,注意不要剧烈的震荡,以免DNA断裂; 4、室温下,6000g离心10分钟,收集上清液; 5、按上述方法再将土样残渣抽提一次(重复2、3、4,提取液由10ml变为6ml),合并上清液;(以上步骤为细胞的裂解以及蛋白质、脂类以及腐植酸等杂质的去除) 6、在上清液中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)(去蛋白质以及直链淀粉),颠倒混匀放置10min,16000g 18℃离心20min,收集水相; 7、再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),抽提一次,颠倒混匀放置10min,16000g 18℃离心20min,收集水相; 8、用加入0.6倍体积的预冷(-20℃)异丙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠(pH5.2)室温沉淀1-2h(到有白色沉淀出现),16000g 25℃离心20min,弃上清液; 9、用75%乙醇漂洗2-3次,真空干燥或者是冷冻干燥,或者是室温自然干燥,加dd水或者是TE缓冲液重悬浮(体积为100-500ul,根据DNA的量决定),备用(或者是根据实验需要过DNA纯化柱)。 方法二液氮冻融法 1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),装于50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入65℃预热的提取液10ml(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V])(1 2); 2、漩涡震荡混匀,或者是250rpm混匀5min,然后在液氮和65℃水浴的条件下反复冻融3-5次; 3、冻融结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,160ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴2.0 h,每隔20min上下颠倒混匀一次,注意不要剧烈的震荡,以免DNA断裂; 以下步骤同方法一 方法三液氮研磨法 1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),放于盛有液氮的研钵中,研磨,研磨3-5次,直至土壤样品呈粉末状(液氮挥发的越慢,说明研磨的越充分); 2、将研磨好的土样装入50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入65℃预热的提取液10ml(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP, 2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V],160ug/ml的蛋白激酶K)(1 2),漩涡震荡混匀,或者是250rpm混匀5min; 3、然后加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl, 2%[W/V] SDS),65℃水浴2.0h,每隔20min上下颠倒混匀一次,注意不要剧烈的震荡,以 免DNA断裂; 以下步骤同方法一(每种方法做三个处理) 方法四冻融溶菌酶法 1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),装于50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入37℃预热的10mlDNA提取液(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl, 2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V],6mg/ml溶菌酶,)(1 2),漩涡振荡混匀,然后再37℃下水浴40min,水浴期间,每隔10分钟左右,混匀样品,水浴结束后,将样品在液氮和65℃水浴的条件下反复冻融3-5次; 2、漩涡混匀样品,然后再在37℃下水浴30min,水浴期间,每隔10分钟左右,混匀样品; 3、水浴结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,160ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴1.5h,期间上下颠倒混匀4次左右;以下方法同方法一 方法五液氮研磨溶菌酶法 1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),放于盛有液氮的研钵中,研磨,研磨3-5次,直至土壤样品呈粉末状(液氮挥发的越慢,说明研磨的越充分); 2、将研磨好的土样装入50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入10ml提取液(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V],6mg/ml溶菌酶)(1 2),漩涡震荡混匀,在37℃下水浴40分钟,水浴期间,每隔10分钟左右,混匀样品; 3、水浴结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,160ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴1.5h,期间上下颠倒混匀4次左右;以下步骤同方法一 方法六液氮研磨液氮冻融法 1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),放于盛有液氮的研钵中,研磨,研磨3-5次,直至土壤样品呈粉末状(液氮挥发的越慢,说明研磨的越充分),然后将研磨的土样装于50ml离心管中,向装有土壤样品离心管中加入10ml提取液(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA, 200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V])(1 2),漩涡震荡混匀,然后在液氮和65℃水浴的条件下反复冻融3-5次; 2、漩涡振荡混匀,然后再37℃下水浴40min,水浴期间,每隔10分钟左右,混匀样品; 3、水浴结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,80ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴1.5h,期间上下颠倒混匀4次左右; 以下步骤同方法一