生物制品_质量标准内容及结构确证内容
生物技术药物的质控体系—质量标准研究内容
检定方法、质控标准
, 理化性质:外观(形状、颜色、气味)、pH
, 均一性:纯度、浓度
, 鉴别
, 结构确证
, 效价:生物学活性、免疫学活性
, 残余杂质:产品、工艺、环境相关的杂质
, 起草、制定《制造与检定规程》
, 研究建立国家标准品或参考品 重组蛋白质药物质量标准研究
, 效价:生物学活性与比活性
, 蛋白质纯度
, 蛋白质含量
, 理化性质鉴定(部分非常规)
, 残余杂质
, 安全性及其它项目
一 生物学活性及比活性测定 (一) 检测意义
获取准确的效价信息,保证产品有效
效价:有效性指标,反映药品效力
生物学活性才能真实反映生物技术药效价 原因:生物制品分子大、结构复杂、不稳定,使得重量与效价不一致
生物制品技术药:~单位(U、AU、IU) (二) 生物学活性测定方法分类 1、动物基础的活性测定
离体动物器官法:脑利钠肽的兔主动脉
体内测定法: EPO的小鼠网织红细胞 2、细胞基础的活性测定
, 促细胞生长法:大多数细胞因子类
, 抑制细胞生长法:细胞毒素、血管抑制剂
, 间接保护细胞法:IFN保护WISH 3、酶学基础的活性测定:重组酶类
4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定:
抗原决定簇与活性中心常不一致 (三)生物学活性测定方法选择 1、细胞培养法,离体器官法,体内法
2、细胞染色标记方法: MTT ,3H-Thymidine ,流式细胞仪 (测细胞周期、凋亡)
3、定量法,半定量法,定性法
4、生物学活性不一定与临床药效类型一致 工艺稳定、测生物活性特别复杂时,可替代。 如rh-GH用HPLC
(四)生物学活性测定(见药典附录?C) 1、样品:原液、成品
2、方法:如上述(好好研究,,,,) 3、标准:
不同生物活性测定方法的
标准
测定方法 规定标准 动物基础的活性测定 70%-130%标示量 细胞基础的活性测定 80%-120%标示量 酶学基础的活性测定 85%-115%标示量 结合反应的活性测定 85%-115%标示量 (五)蛋白质药物的比活性(见分生实验册77页),,,
1、样品:原液
2、定义与计算:
比活性:单位重量蛋白的活性单位数(IU/mg) 3、标准:不小于。。。IU/mg
4、意义:
1)真实反映有活性的蛋白质所占的比例
厂家间、
达系统间、批间比较
2)便于配制成品
二 蛋白质纯度检查
, 样品:原液
, 方法:必须采用二种方法测定
非还原SDS-PAGE法
HPLC法
, 标准:纯度均须达到95%或98%以上 非还原SDS-PAGE法测定纯度(见药典附录?C)
, SDS-PAGE:据分子大小分离
, 样品处理:样品不加β-ME或DTT
二硫键未打开,反映单体、二聚体或多聚体情况
, 染色方法与上样量
银染: 5ug(检测限为1-10ng)
考马斯亮蓝R-250:10ug(检测限为0.1ug)
, 定量方法:凝胶扫描
, 标准:无明显杂带,纯度?95%或98% HPLC法测纯度,,,(见药典附录?B)
, 分析柱:反相柱、离子柱、分子筛
应尽量采用反相柱或离子柱
应注明采用的分析柱性质
, 上样量:5ug
, 标准:出峰时间正确 纯度:?95%或98% 三、蛋白质含量测定(见药典附录?D)
, 样品:原液、成品
, 方法:
*Folin-酚试剂法(Lowry法):(见分生实验册67-73页)
简便、灵敏、优先采用,灵敏度:5-100ug/ml
*染色法(Bradford法):
考马斯亮蓝G-250,简便灵敏, 25-200ug/ml BCA(二喹啉甲酸)法:
操作简单,比Lowry法快4倍且更加方便,准确灵敏:20~200 ug/ml,微量BCA的测定范
围在0.5~10 ug/ml。经济适用 ,抗试剂干扰能力比较强。 紫外分光广度法:
用于原液比活性计算和成品规格控制
四、蛋白质药物理化性质鉴定
(一)特异性鉴别试验
1、样品:原液和成品
2、方法:免疫印迹法
Western Blot、 Dot Blot
3、标准:应该阳性
(二)相对分子量测定
1、样品:原液
2、方法:还原型SDS-PAGE(见分生实验册51页、见药典附录?C)、质谱法
3、标准:
1)理论值?10%范围
2)批与批间一致
(三)等电点测定(见药典附录?D) 1、样品:原液
2、方法:
IEF:常规等电聚胶电泳(见分生实验册55-57页)
CE:毛细管电泳
3、标准:
1)有明显主带
2)理论值?0.5pH范围
3)批与批间一致
(四)紫外吸收光谱分析(见药典附录?A)
1、样品:原液
2、方法:紫外扫描
3、标准:
1)最大吸收波长与特征波长一致
2)批与批间一致
(五)肽图分析(非常规)(见药典附录?E)
1、样品:原液
2、方法:
溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/ SDS-PAGE/CE/质谱法 3、标准:
1)有特征性图谱
2)批与批间一致
(六)氨基酸组成分析(非常规) 1、样品:原液
2、方法:
HCl/NaOH水解(仅用于Trp测定)
+氨基酸自动分析仪
3、标准:
1)与理论值一致
2)批与批间一致
(七)氨基酸序列分析(非常规) 1、样品:原液
2、方法:
N末端: 15个残基,
Edman化学降解法,蛋白质全自动测序仪
C末端: 1-3个残基
硫氰酸酯/羧肽酶降解法,RP-HPLC
3、标准:
1)与理论值一致
2)批与批间一致
(八)其它:二硫键、糖基化(非常规) 五、残余杂质检测
(一)宿主相关杂质
宿主细胞蛋白含量:(见药典附录?C) 1、样品:原液、成品
2、方法:
双抗体夹心ELISA:用HAS作保护
宿主蛋白标准品:中检所提供
3、标准:
1)大肠杆菌?0.1%
2)CHO ?0.05%
宿主细胞DNA含量(见药典附录?B) 1、样品:原液、成品
2、方法:
DNA点印迹杂交法,地高辛标记
DNA标准品:厂家提供
3、标准: DNA含量?10ng/剂量
细菌内毒素含量(见药典附录?E凝胶限量实验)
1、样品:原液、成品
2、方法:
鲎试剂分析法
鲎试剂标准品:中检所提供
3、标准:
内毒素含量?1,,,/剂量
(二)工艺相关杂质(见药典附录?A)
如残余抗生素、IgG、蛋白A、小牛血清 (三)产品相关杂质
如多聚体、不同的PEG修饰产物 六、安全性及其它检测项目 (一)无菌试验
平皿法,需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体 (二)热原试验
鲎试剂法或家兔法
(三)异常毒性试验
小鼠(1ml)或豚鼠(5ml),腹腔注射 (四)水分、装量、pH值
原液质量标准
, 生物学活性、比活性(见药典附录?C)
, 蛋白质含量(见药典附录?D)
, 纯度:?95%,非还原SDS-PAGE法(见药典附录?C)、HPLC法(见药典附录?
B)
, 分子量:还原型SDS-PAGE法(见药典附录?C)、质谱法
, 外源性DNA残留量: ?10ng/剂量(见药典附录?B)
, 宿主蛋白残留量: ?0.1%,0.05%(见药典附录?C)
, 残余抗生素:不得检出(见药典附录?A)
, 细菌内毒素:?10EU/剂量(见药典附录?E凝胶限量实验)
, 结构确证:等电点(见药典附录?D)、紫外吸收光谱扫描(见药典附录?A)、N末
端15个氨基酸顺序、肽图(见药典附录?E)、(氨基酸组成、)
成品质量标准
, 鉴别试验:免疫印迹法/斑点法,阳性
, 物理检查:外观、可见异物、装量
, 化学检定:水分、pH值
, 生物学活性:标示量的%范围
, 无菌检查:不得检出
, 内毒素检查: ?10EU/剂量
, 异常毒性检查:符合规定