清开灵干预新生大鼠缺氧缺血脑皮质白介素6及fasl蛋白的实验研究
清开灵干预新生大鼠缺氧缺血脑皮质白介
素6及FasL蛋白的实验研究
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sp; 作者:陈敬国~方慧云~蒋犁~程敏婷
【关键词】 脑缺氧,,,脑缺血,,,新生大鼠,,,清开灵,,,白介素-6,,,Fas-L蛋白
摘要:目的探讨缺氧缺血脑损伤对新生大鼠HIBD脑皮质IL-6放射免疫浓度~Fas-L蛋白表达的影响~及清开灵对新生大鼠HIBD的干预治疗作用以及有关分子机制。
建立HIBD动物模型后分为放射免疫法测定组和免疫组化测定组~每组又分为清开灵干预组、生理盐水对照组、假手术组~根据检测需要~在缺氧缺血后24 h~3 d~7 d作IL-6脑皮质匀浆放射免疫浓度测定、Fas-L蛋白免疫组化SP法测定。结果?脑皮质组织匀浆IL-6放射免疫浓度,pg/ml,假手术组、生理盐水组、清开灵干预组:24 h依次为50.1〒6.2,56.3〒7.1,51.3〒6.8;3 d依次为50.6〒6.4,250.3〒11.2,78.1〒8.3;7 d依次为51.4〒6.6,345.7〒12.3,81.2〒9.2,生理盐水组与另两组分别比较,24 hP均,0.05,无明显变化;3,7 d生理盐水组增加明显P<0.05)清开灵干预组降低明显P<0.05)。???左脑皮质Fas-L蛋白表达阳
性率假手术组、生理盐水组、清开灵干预组:24 h依次为
8.04〒3.50,120.20〒6.10,21.10〒5.10;3 d依次为8.20〒
3.10~87.6〒5.90,13.40〒4.20;7 d依次为8.01〒
2.80,8.32〒2.90,8.26〒2.83;生理盐水组与另两组分别比
较~7 dP均,0.05~无明显变化,24 h,3 d增多明显
,P<0.05,~清开灵干预组降低明显,P<0.05,。结论
?新生大鼠HIBD后24 h~3 d,7 d脑皮质IL-6含量逐渐增
高。?清开灵能降低新生大鼠HIBD脑皮质IL-6的产生量。
?新生大鼠HIBD后~结扎侧脑皮质fas-L蛋白表达增高。
?清开灵能抑制新生大鼠HIBD结扎侧脑皮质fas-L蛋白的
高表达。
关键词:脑缺氧, 脑缺血, 新生大鼠,
清开灵, 白介素-6, Fas-L蛋白
Effects of QingKaiLing on the Radioimmunologic Concentrations of IL-6, the Expression of Fas-L Protein in the Cortex in Neonatal Rats after Hypoxic-ischemic Brain Damage
Abstract:ObjectiveTo explore the immunologic changes of interleukin-6(IL-6), the expression of
fas-L protein of cortex in newborn rats after HIBD and the effects of QingKaiLing on them.MethodsTo divide animals for experiment into groups: IL-6 test group: Animals were divided into sham group, NS group and QingKailing group, IL-6 radioimmunologic
concentrations of cortex were measured at 24 h, 3d and 7d after hypoxia ischemia by radioimmunoassay. Immunohistochemistry group: Animals were divided into sham group, NS group and QingKaiLing group. The changes of expression of fas-L protein were detected at 24h, 3d and 7d after hypoxia ischemia by
immunohistochemistry.ResultsComparing with the sham group, the concentration of IL-6 and the expression of fas-L protein (at 24h, 3d and 7d) increased obviously in the ligated side of the brain cortex in NS group (P,0.05 . Comparing with NS group, they were on the contrary in QingKaiLing group(P,0.05,.ConclusionThe
concentration of IL-6, the expression of fas-L protein become higher rapidly after HIBD. QingKaiLing can inhibit the production of IL-6 and the expression of fas-L protein.
Key words:Cerebral-hypoxia; Cerebral-ischemia; Neonatal rats;
QingKaiLing; IL-6; Fas-L protein
新生儿缺氧缺血性脑损伤,neonatal hypoxic-ischemic brain damage~HIBD,是围生期中的胎
儿或新生儿由于各种因素引起的缺氧缺血~脑血流减少或暂
停而导致的一种疾病~是窒息后的严重并发症~是导致儿童
神经系统伤残的常见原因之一~严重的缺氧缺血性脑损害可
产生永久性神经系统缺陷~如脑瘫~智力低下~学习障碍~
癫痫等,1,。由于西药毒性作用大~疗效不肯定。我们试图
从我国中药宝库中寻找治疗HIBD的有效药物~观察其疗效
和作用机制~现将研究
如下。
1 材料与方法
1.1 动物由东南大学医学院实验动物中心提
供同窝7日龄Sprague-Dawley大鼠~雌雄不限~平均体重
约12.0~15.8 g。
1.2 试剂
1.2.1 IL-6放射免疫检测试剂盒:购自天津九鼎生物
有限公司。
1.2.2 Fas-L免疫组化染色试剂盒:由武汉博
1士德生物工程有限公司提供。
1.2.3 清开灵注射剂:购自山西太行山制药厂。
1.3 方法
1.3.1 围生期HIBD动物模型的制作按照Rice方法~取出生7日龄的SD大鼠。乙醚吸入麻醉1~2 min后仰卧~四肢固定于手术板上~做颈正中切口游离左侧颈总动脉~4号手术线结扎左颈总动脉~缝合切口~于原饲养环境恢复2.5 h后放入缺氧舱容器中~该容器中连续灌入37?恒温水~以1.5 l/min的速度输入8%O2~92%N2混合气体~持续2.5 h。
1.3.2 实验动物分组处理72只新生大鼠,7日龄,随机分为3大组~每组24只~每大组分为3个时间点小组:24 h~3 d和7 d~每小组8只~一大组为清开灵干
预组~首先用Rice方法建立新生大鼠HIBD模型~于结扎左侧颈总动脉后恢复2.5 h~缺氧后腹腔注射清开灵10 ml/kg/d~分别于24 h~3 d和7 d断头取脑~用左侧脑皮质匀浆作IL-6放射免疫浓度测定~二大组为生理盐水对照组~基本方法如上~生理盐水腹腔注射剂量为10 ml・kg-1・d-1~3大组为假手术组~单纯游离左侧颈总动脉不结扎~不缺氧~其余方法如上。免疫组化测定:72只7日龄新生大鼠分组实验方法如上~于每一时间点取脑~中性甲醛固定脱水~透明~包埋和切片~采用免疫组化SP方法染色~检测各组皮质部位fas-L蛋白的表达。
1.4 结果统计分析各项检测指标均以〒s表示~采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析~和q检验~结果P,0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脑皮质IL-6放射免疫浓度测定结果在实验中观察到:与假手术组相比~生理盐水对照组脑皮质组织匀浆IL-6的放射免疫测定浓度在24 h无明显变化~3 d~7 d~IL-6增高明显(P<0.05),与生理盐水对照组相比~清开灵干预组脑皮质组织匀浆IL-6的放射免疫测定浓度在24
h无明显变化~3 d~7 d IL-6的放射免疫测定浓度降低明显(P<0.05)。结果见表1。
表1 3组新生大鼠HIBD脑组织皮质部位IL-6放射免疫浓度(略)
与假手术比较~*P,0.05~与生理盐水对照组比较~?P,0.05,n=8
2.2 脑组织皮质部位Fas-L免疫组化检测结果染成棕黄色的细胞为阳性细胞~实验中观察到~与假手术组相比~生理盐水对照组结扎侧脑皮质部位Fas-L在蛋白水平上在7 d变化不大~24 h,3 d表达明显增高,P<0.05〉~与生理盐水对照组相比~清开灵干预组在24 h,3 d表达增高不明显,P<0.05,~在7 d变化不大,P>0.05,。结果见表2。
表2 3组新生大鼠HIBD脑组织皮质部位Fas-L蛋白表达阳性率(略)
与假手术比较~*P,0.05~与生理盐水对照组比较~?P,0.05,n=8
3 讨论
在中枢神经系统内~IL-6主要由胶质细胞产生~包括小胶质细胞和星形胶质细胞。脑缺血及缺血再灌注后小胶质细胞迅速激活~增殖~并聚集于损伤部位。小胶质细胞激活在脑缺血再灌注中的作用具有双重性。一是神经营养作用~可转化为吞噬细胞~吞噬死亡神经细胞残骸和变性的神经突触~合成新的神经结构,分泌IL-6~α干扰素~转化生长因子,TGF,β~胰岛素样生长因子-1和碱性成纤维细胞生长因子等神经营养因子~促进组织修复~支持神经元的存活。二是神经细胞毒性作用~通过与神经细胞的直接接触~胞内吞噬神经细胞~另外释放~分泌一系列潜在的神经毒性物质和炎性因子~如氧自由基、超氧化物等而致脑损害,2,。星形胶质细胞具有抗原呈递和分泌细胞因子等作用。最新研究表明缺血可诱导星形细胞的坏死与凋亡~正常情况下星形细胞IL1α~IL6与TNFα等细胞因子的mRNA表达水平很低~但在缺血时则表达显著增加,而且这些细胞因子的表达水平与缺血时间有关~在脑缺血后IL1α最先表达~TNFα次之~IL6表达最晚,3~4,。此前国外已有人作过脑组织IL-6 mRNA及其蛋白表达的研究与此结论相符。IL6是一种重要的细胞因子。有实验,5,将IL6直接注射至大鼠脑内~可明显减
轻缺血性脑损害的体积~表明IL6对HIBD脑组织有保护作用。 有研究,6,表明~缺氧缺血可导致神经细胞的坏死~ 亦存在凋亡过程发生~有关“凋亡基因”的改变已引起人们的关注~Fas及其Fas-L就是其中的“凋亡基因”的一部分。Fas-L多肽是一种35KD膜表面受体蛋白~由319个氨基酸组成~Fas-L蛋白胞浆区的一段60~70个氨基酸序列与TNF受体高度同源~对介导细胞死亡是必须的~称为死亡域,Fas-L蛋白复合三聚体具有诱导凋亡的能力~并通过死亡域间的相互作用促进Fas-L蛋白聚合而传导死亡信号~激活转录因子NF-KB~启动靶细胞内的凋亡程序。实验显示Fas-L蛋白表达增多时~凋亡明显可见~干预治疗后Fas-L蛋白表达减少~说明Fas-L与凋亡密切相关。还观察到Fas-L蛋白表达高峰时间较前~后逐渐减少~这说明它引起凋亡的作用时间较早。本实验研究表明Fas-L蛋白在正常新生大鼠脑内弱表达~缺氧缺血后病变部位出现散在分布的强阳性细胞~多是凋亡脑细胞~表明Fas-L与脑细胞凋亡有直接的关系~Fas-L参与了脑细胞凋亡的过程~Fas-L的作用是HIBD的发病机制之一。经干预治疗后~Fas-L的蛋白表达减少。说明早期干预阻抑了脑细胞的凋亡进程~对神经组织有明显的修复保护作用。另外在实验结果中~我们观察到脑损伤后随着时间的推移~Fas-L的蛋白表达明显减少~显示Fas-L参与凋亡的作用时间较早。中药清开灵注射液是在《温病条辨》安宫牛黄丸的
基础上研制而成的一种纯中药复方针剂~其主要成分有:牛黄、水牛角、珍珠母、黄芩、栀子、金银花、板蓝根等。研究表明~清开灵注射液具有改善脑循环~抑制血小板聚集~降低血黏度抑制过氧化脂生成~抗自由基,7,~对抗兴奋性氨基酸对脑组织损伤,8,等作用。动物实验也证实~清开灵对缺血性,9,及感染性 ,10,脑损伤均有保护作用。但其抗脑损伤的具体机制尚未完全清楚~有动物实验显示清开灵可影响脑内乙酰胆碱酯酶活性和谷氨酸含量,11,~提示清开灵的作用机制可能与脑内中枢神经递质有关。本实验结果显示~清开灵它能明显减少脑组织IL-6的分泌~能抑制新生大鼠HIBD结扎侧脑皮质fas-L蛋白的高表达~对缺氧缺血脑损伤有重要康复作用。
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