武汉大学基因工程（李立家）2012d

nullnull第七章转基因动物6.1动物转基因技术 转基因动物（transgenic animal）是指用DNA重组技术将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，使外源目的基因随细胞的分裂而增殖并在体内达，且能稳定地遗传给后代的动物。null转基因动物的关键技术包括：(1)外源目的基因的分离 (基因的克隆及重组DNA的制备等)；(2)外源目的基因与专性基因表达起动子、增强子、基因等构件的拼接重组；(3)外源目的基因重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞；(4)胚胎移植技术 (Embryo Transfer，ET)；(5)转基因胚胎发育生长鉴定及筛选转基因动物品系；（6）目的基因整合率及表达效率的检测。在这些程序中最重要的方法是成功地把外源目的基因转入动物早期胚胎细胞中。 null6.1.1 显微注射法 在显微操作仪下用极细的微吸管将在体外构建的外源目的基因注射到处于原核时期的受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖过程中通过DNA的复制而整合到动物基因组中，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物 null显微注射法的不足点 不足之处有(1)外源基因整合的效率低（尤其是大家畜）； (2)不能控制转基因的整合位点； (3)整合的拷贝数未知； (4)一个转基因可形成几个基因型或显型的品系； (5)显微操作复杂、设备昂贵、技术性强; (6)胚胎高死亡率及大型农场动物原核的定位困难。 null6.1.2 逆转录病毒法 逆转录病毒法是将外源目的基因和逆转录病毒载体重组，再使之包装成为高滴度病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的。携带外源基因的反转录病毒DNA依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异性核苷酸序列可以整合到宿主染色体上，经过杂交筛选即可获得含有目的基因的动物。 nullnull逆转录病毒介导的基因转移技术的优缺点： 具有操作简便、可大量感染细胞、形成单拷贝和高转化率（可达100％）等优点； 病毒载体可能从整合位点上脱落，恢复病毒特性，对宿主细胞的功能造成影响，甚至使动物死亡。逆转录病毒载体容纳外源基因的DNA片段较小（≤10kb），而且获得的子代动物嵌合体的比例大。 null6.1.3 胚胎干细胞法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团（inner cell mass，ICM）中分离出来的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能分化的潜能，在适当的环境条件下可形成胚系集落。 null 将外源目的基因转移到ES细胞中，外源基因整合到ES细胞的基因组中，把ES细胞移入胚泡期的胚胎，再把这样的胚胎移植到假孕的代孕子宫内发育，产生出嵌合体动物，进一步获得生殖系携带外源基因的纯合转基因动物。 nullA. ES基础上的基因打靶技术 所谓的基因打靶（gene targeting）技术是通过在转化ES细胞中发生的外源基因与核基因组目标基因之间DNA同源重组，进行单或双交换，实现基因的插入或替换，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。 nullB. 引入可选择标记基因的三种方式 1）无启动子的标记基因(氨基糖苷酸抗生素G418） 2）负选择标记基因（tk-neo）-定位整合 3）polyA信号序列的标记基因null6.1.4 精子载体法 它是直接用精子作为外源DNA的载体，精子直接与外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。 null经膜处理的携外源DNA精子的卵母细胞微注射 胞质内显微注射法制备转基因哺乳动物具有其他方法没有的优势。1）胞质内显微注射使用的微注射针大，能处理较大的DNA片段，如酵母或哺乳动物人工染色体；2）对大型农场动物如牛、猪等而言，其合子是不透明的，原核不易见，原核显微注射较为困难，应用该法可克服此缺陷；3）不同物种中，精子可以保存并且能支持完全发育；4）将精子与几种不同外源目的基因共注射，可通过单次注射获得同时表达多个基因的胚胎。 null6.1.5 体细胞核移植法 将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞（包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等），以这些动物体细胞为核供体，通过显微操作或电融合使核供体与相应的核受体（去核的原核胚或成熟的卵母细胞）不经过有性繁殖过程，在体外直接进行重组融合，对重组的胚进行胚胎移植，进而得到带有外源基因的转基因动物。null核移植法制备转基因小鼠的过程 null动物克隆null 基因转移效率高，转基因动物后代数目也迅速扩增，所需动物数大幅度减少，比显微注射法所需动物数减少2.5倍 (绵羊 )。更重要的是，在胚胎移植之前，它就筛选阳性细胞作为核供体，这样核移植产生的胚胎为阳性，最终产生的后代个体100%为转基因个体。可以预先选择雄性或雌性性别克隆，从而预定胚胎和后代的性别。同时它可以实现大片段基因的转移。毫无疑问体细胞核移植技术仍然存在一些问题比如就目前的体细胞克隆技术而言，成功率是很低的，以Dolly为例，其成功率只有1/277，这就制约该技术在生产中的应用。 null 虽然目前使用的制备转基因动物的方法也不少，但总体看来，仍不是十分理想，效率较低。 原核注射法是最常用和获得转基因动物最多的经典方法； 反转录病毒载体法在禽类基因转移上应用较多，效果较好； 经膜处理精子胞浆微注射法结合了原核微注射和精子载体法各自的长处； ES细胞介导法是和基因定位整合相结合的方法，可以克服外源基因随机整合所带来的一些弊端，而且可在体外条件下对外源基因的表达进行筛选。 6.1.6总结null6.2 转基因动物研究存在的问题及对策1．转基因动物成功率低 阳性率结果重复性差，甚至无法重复，转基因动物的成功率较低。随后的研究虽然使成功率有所提高，但总的成功率还是较低，限制了其应用的发展。建立更完善的转基因方法。使用大的外源DNA片段。 2．造成宿主基因突变问题 外源基因在动物基因组中的随机整合，可能会引起宿主细胞基因的插入突变、缺失突变及宿主基因的扩增重排和移位，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因，从而导致动物表型的改变甚至造成动物不育或死亡。基因打靶技术（gene targeting）能够使目的基因定点整合，因此避免了对宿主基因的损伤，提高了阳性率。 null3．外源基因表达水平不高 转入的外源目的基因在转基因动物中是否高效表达是转基因动物研究成败的关键。对外源基因的整合机理进行深入研究。选择表达效率高的启动子。 4．安全性问题 插入的外源基因是否会影响宿主动物自身的基因表达及表达水平；转基因动物是否可能会把外源基因传递给生活在其周围的其它种群及环境，造成基因污染；在病毒等致病基因的转基因研究中，不可避免地会产生一些有害的转基因动物，是否可能因为使用转基因动物制品而将一些动物性疾病传递给人类。 null6.3 作为生物反应器的优势 将编码活性蛋白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内以制备转基因动物，并使外源基因在动物体内 (乳汁、血液等 )高效表达，然后再分离提取目的基因编码产物。动物就像一个活的发酵罐。其温度、气体、水分和pH值均由动物自身调节。所以有人把它喻为药物工厂、生物反应器、基因农场或分子农场（molecular farming）。 转基因动物作为生物反应器，其特点有：表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性，产品成本低，并可进行大规模的生产；产品质量高，可诱导分泌，易提纯，不污染环境。 null6.4转基因动植物的争论 转基因工程是不可阻挡的.基因工程将影响当代重大的环 境问题:人口过剩/污染/生物多样性急剧减退等等.保护土 壤/水/能源成为发展可持续农业的目标. “除非我们找到生 产粮食的更好方法,否则我们得为自己另找一个星球.” （老百姓了解的仅仅负面消息与知情权) ☆对环境的安全性 ☆对人类健康的安全性 ☆宗教及伦理问题 null1 外源基因引入是否会破坏细胞重要生长基因或激活癌基因？ 2 是否会造成致病力极大、难以控制的微生物？ 3 经基因改良的生物体是否会对环境造成危害？(生态平衡) 4 抗除草剂或抗病基因是否会进入杂草导致相反的效果？ 5 降低自然界遗传多样性？ 6 人是否可以成为基因操作对象？ 基因诊断是否会侵犯人类隐私权？ 7 克隆人问题？8 遗传检测问题？ 宗教问题？10 动物保护问题？ 11 转基因毒性:人的理反应或过敏反应? 12 未知的? 转基因生物的安全性争论转基因生物的安全性争论支持派认为： 如果转基因生物技术得不到社会支持，这一研究将被扼杀。 迄今为止并没有发现转基因食品危害人体健康和环境的确切证据。null从理论上讲，基因工程中所转的外源基因是已知的有明确功能的基因。 它与远源有性杂交中的高度随机过程相比，其转基因后果应当可以更精确地预测，在应用上也更加安全。null “基因”本无害 “基因”本无害 基因只是一段 DNA，是营养物质，食物中到处都是；基因的产物是蛋白质，蛋白质一般无毒。 核酸保健品？？其实所有作物都被长期改良过其实所有作物都被长期改良过 长期筛选优良性状的结果是,所有作物的基因背景都与野生植物有很大的差异,它们的生存能力不如对应的野生植物, 广义上都是转基因作物。作物也都有有毒物质,只是我们都已经适应了。 动植物的毒性是进化的结果动植物的毒性是进化的结果植物：合成对动物有毒的化合物 动物：合成毒素攻击或预防攻击 微生物：合成毒素保护自己，杀死其他生物 G6PD deficiency:Favism 蚕豆病 医学上叫“血红细胞B-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症” 春季吃新鲜的蚕豆后出现腹痛，黄疸。是一种以黄疸贫血为主要特征的溶血性疾病。引起“蚕豆病”原因有：一是有的人在蚕豆收获季节里大量进食新鲜蚕豆，使摄入的裂解素和多巴醌等有毒物质超过一定数量而中毒发病。另一个原因是有的人本身患有“遗传性血红细胞缺陷症”，他们在进食新鲜蚕豆或吸入蚕豆花粉后，其中的有毒物质可使体内血红细胞被氧化破坏而发生溶血性病变。 反对派的观点反对派的观点一英国科学家声称，转基因马铃薯会减弱老鼠免疫系统功能； 美国康乃尔大学也发现，转基因玉米会危害蝴蝶幼虫及其相关生态环境。 null 转基因生物对农业和生态环境的影响；  产生超级杂草的可能性；  种植抗虫转基因作物后可能使害虫产生免疫并遗传、从而产生更加难以消灭的“超级害虫”；nullGREENPEACE INTERNATIONAL 欧盟国家对转基因作物更加排斥 抵制美国GMO产品的进口null你吃过转基因食品吗？ 不管您愿不愿意，您己经或正在把转基因食品吃进肚里 null转基因食品已经走进我国百姓的生活。 国内尚没有转基因粮食作物的大规模生产。 近几年我国大量从美国、阿根廷等国进口大豆，其中大部分是转基因大豆。 我国有一半以上的大豆色拉油含有转基因成分。null1、改良植物的食用品质  改变油料作物  改变淀粉组成及含量  提高谷物食品的赖氨酸含量  提高小麦烘焙性能  改变大豆中的蛋白质、氨基酸转基因食品的功效null2、增加果蔬贮藏、保鲜性能  转基因番茄  转基因香蕉、猕猴桃  转基因荔枝null 3、生产特殊食品——食品疫苗  狂犬病抗原  乙肝表面抗原  链球菌表面抗原  流感表面抗原 将以上基因转移到马铃薯、香蕉、番茄等十多种作物上，生产食用疫苗。为什么会对转基因食品有恐惧心理？为什么会对转基因食品有恐惧心理？转基因食品在基因重组与改变过程中，可能产生某种毒性、过敏性，生成抗营养因子。引起营养成分改变，或者某种抗抗生素基因随食品转移到肠道，使抗生素对该机体从此失去疗效。 就目前而言，还没有发现转基因食品对人类有害，但同时也缺乏证据证明它的无害性，因此产生了一些争论。吃转基因植物不会被转基因吃转基因植物不会被转基因如果我们吃东西就会自己也被转基因，这个世界早就不是这样了，我们就会拥有大量的植物基因，有些人还会有叶绿体, 肚子饿了只要晒晒太阳……null5.7哲学与基因工程1.人类最初只是强力干预物理世界,后来又开始强力干预化学世界,现在又轮到生物世界了.它们与人的距离越来靠近,技术应用的风险也越来越大.2.无论科技如何进步,自然永远隐藏着无限的未为人知的奥秘,我们对自然的了解永远只是沧海一粟,故它永远握有惩罚人类的权力.干预越强,反作用力也越强.null3.人类在技术追求上应该适度.4.科学应该注重和哲学合作,以达到对世界/社会/人生博大圆融的理解,而不是屈从于技术,屈从于商业贪欲和军事野心.5.应该追求技术,但技术不必只是征服自然的技术.