橙皮苷提取分离及检测方法研究进展

橙皮苷提取分离及检测方法研究进展 喻明洁1,吕圭源1,陈素红2 ( 1.浙江中医药大学,浙江 杭州 310053; 2.温州医学院,浙江 温州 325035) 摘 � 要:目的:了解橙皮苷提取分离方法及其定性、定量检测方法研究进展。方法:通过查阅中国期刊全 文数据库( CNKI)、中国生物医学文献数据库( CBM)、维普数据库近年相关文献,对橙皮苷提取分 离及检测方法进行归纳。结果:橙皮苷的提取分离方法主要有浸渍、回流、索氏、超声、微波、酶解、 柱层析、超滤等,检测方法有可见- 紫外分光光度法、电化学法、色谱法等。结论:本研究可为橙皮苷的 进一步深入研究提供参考。 关键词:橙皮苷;提取分离;检测 中图分类号: R284 � � � 文献标识码: A � � � 文章编号: 1673- 2197( 2011) 05- 0171-03 收稿日期: 2011- 02-17 � � 橙皮苷(Hesperidin, C28H 34O15 )又名陈皮苷、橘皮苷,是 橙皮素与芸香糖形成的糖苷, 属于二氢黄酮类化合物 [1]。 该纯品为白色细树枝状针形晶体,熔点 258 � ~ 262 � 。天 然存在的橙皮苷为黄色晶体状粉末, 呈弱酸性, 略带苦 味 [ 2]。橙皮苷广泛存在于豆科、唇形花科、蝶形花科、芸香 科、柑橘属植物中, 如柑桔、枳实、柠檬、佛手[ 3] 等。药理研 究明,橙皮苷具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂、维持血 管正常渗透压、增强毛细血管韧性、保护心血管等多种功 效 [ 4]。�中国药典�橙皮苷为鉴定中药陈皮的指标性成 分,在中药新药的创制和研发中,橙皮苷也常常被选为指标 成分用于定性和定量研究中。另外,因橙皮苷产量极高(含 量可达柑橘幼果鲜重 1. 4%) [5- 7] ,近年来,其逐渐成为食品、 日用化工业关注的热点。因此, 对橙皮苷进行有效的开发 利用能获得巨大的经济和社会效益。本文对近几年橙皮苷 提取分离工艺以及检测方法进行了归纳,以期为橙皮苷在 医药、食品等方面进一步开发、利用提供参考。 1 � 橙皮苷提取分离方法 橙皮苷的传统提取分离方法有浸渍法、回流法、索氏提 取法,近年来随着科技发展又出现了超声法、微波法、酶法、 柱层析法以及超滤法等。 1. 1 � 浸渍法 过去常用的一种方法,从提取到精制一步完成。碱提 酸析为该方法的基本原理,析出的橙皮苷通过重结晶而精 制,纯度可达一级品标准,且提取率为 0. 726% [ 8]。 1. 2 � 回流法 因其简单易操作, 是目前应用最为广泛的提取方法。 常用提取溶剂为水、碱性水溶液( NaOH、Ca( OH) 2)、醇溶液 (乙醇、甲醇)、碱性醇溶液等。陈皮粗粉用稀 HCl酸化处理 后用 95%甲醇回流提取,橙皮苷得率为 0. 750% ;经两次重 结晶,纯度可达 94. 7%。 1. 3 � 索氏提取法 为药典规定陈皮中橙皮苷检测的提取方法。取陈皮粗 粉置索氏提取器中,加石油醚加热回流 2~ 3h,残渣再加甲 醇回流至提取液无色 [10]。 1. 4 � 超声辅助法 适用于热敏性成分的提取,提取时间短,提取效率高。 研究表明,陈皮粉经 180W 功率超声 30min,橙皮苷提取率 可达 5. 0%, 且纯度大于 92% [11] ; 超声频率为低频 ( 27. 5 kHz)时,橙皮苷的提取率为 4. 7% [12]。 1. 5 � 微波辅助法(MAE) 该方法使物料从里向外均匀加热,且提取快速。微波 功率为 550W 时, 橙皮苷提取率可达 2. 40% [ 13] ;而陈皮用 200W微波照射,并经石油醚- 甲醇- 60%乙醇分步提取, 橙皮苷得率可达 80% [14]。 1. 6 � 酶法 组成植物细胞壁构架物质主要为纤维素,纤维素酶可使 纤维素降解,进而破坏植物细胞壁,有利于陈皮中橙皮苷溶 出,从而提高橙皮苷提取率,且提取条件温和,对坏境友好。 在纤维素酶- 微波法结合提取橙皮苷的考察中发现,当纤维 素粗酶:干橙粉= 3 � 10时,辅以微波, 橙皮苷提取率高达 6. 13%,优于单用酶解法或微波法 [15]。经酶法改性,再以糖 转移酶处理,可得到化学结构为 4G-�-D-Glucopyranosy-l Hes- peridin,水溶解度达 25g/ 100g(水)以上的水溶性橙皮苷[16]。 1. 7 � 柱层析法 该方法可克服目前普遍采用的溶剂法的缺点,提高产 物得率和纯度。其原理是利用混合物中各组分物理化学性 质上的差异(如吸附力、分子形状与大小、分子极性、分子亲 和力、分配系数等) ,使各组分以不同浓度分布在两相(固定 相和流动相,互补相溶)中,并以不同速度移动,最终彼此分 �171� 离 [ 17]。保和丸提取液橙皮苷经碱溶酸析法提取、D- 101 大 孔树脂纯化后得率为 1. 92%,纯度为 96. 7% [ 18]。柑橘皮中 橙皮苷经大孔树脂分离, 50%乙醇洗脱,得率达 4% [ 19]。 1. 8 � 超滤法 膜分离技术具有保持被提取成分活性、耗能低、选择性 强等特点。柑橘皮提取液,用截流分子量为 30kD聚丙烯腈 膜超滤,经结晶得到橙皮苷纯度在 85%以上[ 19]。冯彪等 [20] 以橙皮苷保留率为指标,进样 20 万分子量超滤柱,当药液 滤出量为 2倍量时,有效成分最多,能达到 75%。 2 � 橙皮苷检测方法 含橙皮苷中药材及其制剂已广泛应用,对所含橙皮苷 进行定量分析是药材及制剂质量控制的主要环节。近年来 用于橙皮苷的主要检测方法有可见- 紫外分光光度法、电 化学法、色谱法等。 2. 1 � 可见- 紫外分光光度法 可见- 紫外分光光度法包括单波长、双波长、三波长以 及导数光谱法,是利用分光光度计在特定波长处,测定样品 溶液吸收度或透光率大小, 计算橙皮苷含量的方法。该方 法灵敏度高,操作简单,费用低, 可随时对产品进行动态监 测,适合企业在分析鉴定橙皮苷时使用。 2. 1. 1 � 单波长 邵伟等 [21]研究发现,橙皮苷在 Al ( NO3 ) 3 蒸馏水体系 中能形成黄色络合物,最大吸收波长为 420nm。该方法具 有实验条件简单、测定迅速、一次性处理量大等优点。 2. 1. 2 � 双波长 严赞开等[ 22]利用橙皮苷能与氢离子形成配离子原理, 在 200~ 700nm 扫描发现 500nm 出现新吸收峰,该峰明显 远离橙皮苷本身特征吸收峰( 273nm)。用此峰测定橙皮苷 时,本身吸收产生的干扰小。 2. 1. 3 � 三波长 三波长分光光度法是对干扰组分的吸收光谱中具有线 性吸收的三个波长进行吸收度测量, 然后通过计算求得橙 皮苷含量的方法。马平勃 [23]用三波长分光光度法测定化痰 糖浆中橙皮苷含量,根据三波长测定吸收度计算 �A 将 �A 与浓度进行回归求得橙皮苷回归方程。该方法样品处理简 便、无需用溶剂反复提取,测定方法快速、可行, 结果稳定、 重现性好。 2. 1. 4 � 导数光谱法 导数光谱是紫外吸收光谱波长的微分系数对波长的函 数图。黄诺嘉 [24]在 240~ 300nm 区间内测定橙皮苷的二阶 导数光谱曲线,在 294. 2nm 波长处量取振幅 D值。该方法 能消除一般紫外光谱中某些干扰或使原光谱中某些细微变 化�放大�,从而改善分辨力。 2. 2 � 电化学法 2. 2. 1 � 极谱法 极谱法由捷克丁 � Heyrovsky教授在 1922年研究提 出,是研究物质在电解过程中所得到电流~ 电压曲线,可作 定性、定量分析的一种方法。胡劲波等 [25]发现,在-1. 0~ - 1. 5V ( vs. SCE)电位范围内,橙皮苷在单扫示波极谱仪上有 一灵敏导数峰,其峰电位为 Ep=-1. 22V ( vs. SCE) , 峰高与 橙皮苷浓度在一定范围内成线性关系;该研究还表明,此体 系具有吸附性的不可逆过程。此法需要样品量少且经分析 后溶液性质基本不变仍可作其他方面试验。 2. 2. 2 � 毛细管电泳法 高效毛细管电泳是 20世纪 80 年代发展起来的一类分 离分析方法,将经典电泳技术和现代微柱分离相结合,具有 高效、高速、微量、操作简单和低耗的优点,在药物分析方面 逐渐得到重视,有了较广泛的应用。韩丽萍等[ 26]采用区带 毛细管电泳法测定藿香正气口服液中橙皮苷含量,能使橙 皮苷与其他成分良好的分离,且迁移时间适中,柱效可达 20 000,峰的纯度较好。该方法高效、快速、进样体积小、溶 剂消耗少、抗污染能力强。 2. 3 � 色谱法 2. 3. 1 � 薄层扫描法 在薄层层析谱上直接测定橙皮苷斑点光吸收度或荧光 强度,计算出橙皮苷含量的一种方法,该法既能起到分离作 用,又能起到分析作用。随着制板、点样的仪器化及仪器不 断完善,薄层扫描法检测的灵敏度、准确度和精密度均大大 提高。 ( 1)薄层吸收光度扫描法:许丹等[ 27]用该方法测定复方 中橙皮苷含量,选择波长 290nm 进行扫描, 结果在 1. 06~ 5. 30�gmL有良好的线性关系。刘方等 [28]用进行双波长反 射吸收法锯齿扫描法测定消气合剂中橙皮苷含量,选择测 定波长�S= 283nm,参比波长 �R= 360nm,在一定范围内线 性关系良好。此方法简便,无干扰,测定准确,重现性好。 ( 2)薄层荧光扫描法:王嗣岑等[ 29]建立了培坤胶囊中橙 皮苷的薄层色谱荧光分析法。制剂通过两次薄层层析处理 后在紫外灯下定位, 激发光波长 �ex = 310nm,发射光波长 �em= 510nm。该法可有效排除共存组分的干扰,并提高检 测的灵敏度。 2. 3. 2 � 高效液相色谱法 用高效液相色谱仪,选择适宜的色谱柱和流动相使橙 皮苷和其他成分分离,以紫外检测器得到峰面积,由峰面积 计算橙皮苷含量。该方法自 20世纪 70年代问世以来,即以 高效分离、灵敏检测和快速分析等特点广泛应用于各个科 学领域。近几年来, HPLC 成为测定陈皮及其制剂中橙皮 苷的主要方法,橙皮苷含量测定用 RP-HPLC法分离效果较 好,流动相一般为甲醇- 水- 磷酸(醋酸)或乙腈- 水- 磷 酸(醋酸)系统,一般在最大吸收处 280~ 286nm 附近测定。 近年来,国内常采用的色谱柱规格、柱填料种类、流动相和 检测波长等色谱分析条件见表 1。 流速一般控制在 0. 8~ 1. 5mL/ min之间,柱温有室温 25 � 、30 � 、35 � ,进样量 5~ 20�L 不等,取决于所用柱子的 大小 [30-39]。 3 � 结语 以前从橘皮中提取橙皮苷主要是浸渍法(碱浸酸析)、 热回流法等,此种方法提取率相对较低。近些年出现了超 声波、微波、柱层析、超滤等辅助手段,能强化提取过程,更 好地保存橙皮苷活性,提高其提取率和纯度。在检测方面, �172� 表 1 � 橙皮苷的 HPLC定量分析的色谱条件 样品 色谱柱 流动相 检测波长( nm) 陈皮 Tu rner C18 乙腈- 0. 4% 磷酸溶液 ( 20� 80) 286 陈皮 XDB-C18 甲醇 - 0. 5% 冰醋酸 ( 40 � 60) 283 陈皮 BDS C18 甲醇 - 醋酸 - 水 ( 30 � 4 � 66) 284 活血通脉片 Diamonsi-l C18 甲醇- 水- 冰醋酸( 33� 67� 1) 284 保和咀嚼片 Luna C18 乙腈- 水- 冰醋酸( 20: 80: 1) 280 胃康胶囊 Centu rySILC18- AQ 乙腈- 0. 2% 磷酸溶液 ( 21 � 79) 284 养胃舒软胶囊 VP-ODS 乙腈- 水- 磷酸( 20 � 80� 0. 4) 286 和胃散 ODS-SP 乙腈- 1%醋酸( 28� 72) 283 驱风合剂 Hy persil ODS 2 甲醇- 水( 45� 55) 283 健脾增肥片 Kromasil C18 甲醇- 醋酸- 水(35�4�61) 283 不仅有以前常用的分光光度法, 也有现已应用广泛的高效 液相色谱法 HPLC 以及技术很成熟的高效毛细管电泳法 ( HPCE)等,这些方法均有其特有的优势,具有很大的发展 潜力。能推动橙皮苷的检测朝着准确、便捷的方向发展。 参考文献: [ 1] � 肖崇厚. 中药化学[ M ] . 上海: 上海科学技术出版社, 1997: 263- 298. 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