基因诊断与基因治疗

nullnull 基因诊断 与 基因治疗 解 用 虹 天津医科大学生化教研室 基因诊断与基因治疗（教学要求） 基因诊断与基因治疗（教学要求） 1．掌握基因的基本概念，熟悉基因的结构与功能， 了解人类基因组的基本和重大意义。 2．掌握基因结构变异及表达水平异常是疾病发生的 关键原因。熟悉基因与疾病关系的复杂性。 3．掌握聚合酶链反应-限制性片段多态性(PCR- RFLP)，聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR- SSCP)和DNA测序生化技术的基本原理以及它们 在基因诊断中的实际应用。 4．熟悉基因治疗的概念，基因治疗病例的基本要 求，基因治疗的基本程序和基因治疗目前的状态 和存在问，了解基因治疗成功和失败的实例。null一. 基因与疾病1 基因的概念1 基因的概念1.遗传学的基因是机体遗传生 物学性状的“遗传因子”，是遗 传的基本单位或单元。 2.分子生物学的基因是负载特 定遗传信息(转录为RNA或翻 译成蛋白质)的DNA片段。遗传学基因概念的提出(1)遗传学基因概念的提出(1) 1865年奥地利僧侣植物学家的孟德尔, （ Gregor Mendel，1822 ~ 1884) 通过豌豆杂交实验发现生物体的遗传性状是由“遗传因子”决定的。 1909年Johnson将Mendel提出的遗传因子命名为基因遗传学基因概念的提出（2）遗传学基因概念的提出（2） 20世纪20年代摩尔根（Thomas Hunt Morgen）通过果蝇实验，确定基因存在于染色体分子生物学的基因概念分子生物学的基因概念 1. 1868年Miescher,F 从脓液中分离出当 时称为“核素”的核酸 2. 1944年Avery,O 等证明肺炎球菌的转化 因子是DNA 3. 1950年Chargaff,E 等揭示DNA分子中 G＝C, A＝T 4. 1953 年Watson,JD和 Crick,FHC提出 DNA分子的双螺旋结构模型 5. 基因就是负载一定遗传信息的DNA片段 2.基因的结构与功能 2.基因的结构与功能 1. 结构基因（可转录序列） 5’非编码序列 前导序列 外显子-内含子 3’非编码序列 2. 调节基因（调节序列） 启动子 增强子 沉默子nullnull3. 人类基因组计划3. 人类基因组计划 基因组就是来自一个遗传体系的全部遗传信息。对于原核细胞，基因组就是单个环状染色体所含的全部基因；对于真核生物，基因组就是一个生物染色体所包含的全部的DNA。人类基因组计划人类基因组计划 人类基因组计划(Human genome project, HGP)与曼哈顿原子弹计划，阿波罗登月计划共称为二十世纪最伟大的三个科研计划 人类基因组计划（ 1993~ 2002 ）的最终目的是确定人类24条染色体的全部核苷酸序列null4. 基因与疾病4. 基因与疾病1.基因与疾病的关系：除外伤性疾病外，所有的疾病都是遗传因素和环境因素相互作用的结果。 2.单基因疾病（如苯丙酮尿症和镰刀状红细胞性贫血等）基因变异是疾病发生的唯一原因。 3.多基因疾病（如糖尿病和冠心病等）基因变异可能是发病的重要原因； 4.其他许多疾病(如心理障碍和智力低下等)也和基因变异密切相关。遗传性疾病日显重要遗传性疾病日显重要1.随着营养性疾病和传染性疾病的减少和控制，遗传性疾病的防治日显重要。 2.遗传性疾病的研究本身极大地推动了分子生物学和临床医学的发展. 遗传性疾病日益增长遗传性疾病日益增长1.10%的妊娠以自发流产告终，50%的早期流产是由于胎儿的染色体异常。 2.4% ～ 6%的新生儿患有不同的先天性缺陷。 3.国内1.3%的新生儿患有不同的先天性畸形，80%是由于遗传性疾病，同时也是1/3新生儿死亡的原因。 4.我国5000万残疾人中，四分之一是由于遗传性疾病造成。 5.我国7 ～ 14岁智商低于50的儿童有大约100万，其中一半归因于遗传性疾病。4.1典型的单基因遗传性疾病4.1典型的单基因遗传性疾病1.家族性高胆固醇血症(FHC) 2.脂蛋白脂肪酶缺陷病(LPLD) 3.镰刀状红细胞性贫血(HbS) 4.腺苷脱氨酶缺陷(ADA) 5.其它如苯丙酮尿症(PKU)等分子病(molecular diseases)分子病(molecular diseases)分子病通常是指源于蛋白质一级结构改变而产生蛋白质功能异常所致的遗传性疾病。究其根本的发病原因主要是编码蛋白质基因的读码框架改变。 1.家族性高胆固醇血症1.家族性高胆固醇血症 2.脂蛋白脂肪酶酶缺陷病 2.脂蛋白脂肪酶酶缺陷病正常血浆清澈透明，甘油三酯（TG）水平低于1.7mmol/L （150 mg/dl） 本病例血浆明显混浊静置后可出现“奶油盖”，高达36mmol/ L（3200mg/dl） LPL的一般简介LPL的一般简介1. LPL(EC 3.1.1.34）由448个氨基酸残基 组成，活性形式为非共价键相连的同二聚体。 2. LPL基因定位于8P 22上，全长30kbp，包 括十个外显子和九个内含子。 3. LPL 活性中心由Ser132- Asp156 -His241 组成，Apo-CⅡ为其激活因子。 4. LPL的功能是水解脂蛋白中甘油三酯为甘油 和脂肪酸，结构缺陷可致异常脂蛋白血症。分子病--脂蛋白脂肪酶变异分子病--脂蛋白脂肪酶变异1.脂蛋白脂肪酶是水解富含甘油三酯脂蛋白中的甘油三酯为甘油和脂肪酸的关键酶，该酶结构和功能的缺陷可致患者血浆甘油三酯水平极度升高 2.成熟的脂蛋白脂肪酶由448个氨基酸残基组成，本病患者经分子生物学检测确定为脂蛋白脂肪酶读码框架误义突变所致null乳糜微粒的代谢null极低密度脂蛋白的代谢3. 镰刀状红细胞性贫血症3. 镰刀状红细胞性贫血症分子病--镰刀状红细胞性贫血分子病--镰刀状红细胞性贫血成人血红蛋白为α2β2 镰刀状红细胞性贫血的病因是 β链结构异常(GAG→GTG) 1 2 3 4 5 6 7 HbA N--Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu- Hbs N--Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu- 4 腺苷脱氨酶缺乏症4 腺苷脱氨酶缺乏症1.腺嘌啉核苷酸的分 解代谢 2.腺苷脱氨酶的功能 3.腺苷脱氨酶缺乏的 影响 4.常染色体隐性遗传 5.人类第一个成功基 因治疗的疾病nullnullnull重度联合免疫缺陷综合征重度联合免疫缺陷综合征 患有重度联合免疫缺陷综合征（severe combined immunodeficiency, SCID）的患者由于体内先天性缺少腺苷脱氨酶（Adenosine Deaminase, ADA），致使细胞内脱氧腺苷大量积累，导致T淋巴细胞中毒死亡。由于缺乏正常人的免疫系统，患者非常容易受到细菌和病毒的感染。患有这种遗传疾病的小孩通 常最后都会因感染而死亡，很难活到成年，即使一场常见的水痘，对于患者来说都是致命的打击，他（她）们只能一直过着一种“与世隔绝”的生活——避免外 出，静静地呆在家里的无菌环境中，无休止地使用大量抗生素来与细菌和病毒作斗争。 严重混合型免疫缺陷综合症的诊断严重混合型免疫缺陷综合症的诊断1.生后反复发作的感染。 2.血检淋巴细胞减少 免疫球蛋白减低。 3.实验室红细胞检查，腺苷脱氨酶活性明显降低,dATP水平极度升高（50倍以上） 4.预后严重不良，死亡率极高严重混合型免疫缺陷综合症的治疗严重混合型免疫缺陷综合症的治疗1. 抗生素治疗 2. 注射免疫球蛋白 3. 静脉注射牛腺苷脱氨酶-聚乙 二醇(bADA-PEG)藕联物 4. 骨髓移植 5. 基因治疗国人第一杀手之争国人第一杀手之争 中国卫生部疾病控制司孔灵芝处长2005年4月15日说，目前癌症死亡已经超越心血管疾病位于我国各类死因的第一位，成为中国人的第一杀手。其中8种癌症又占我国癌症总死亡的80％以上，它们依次是：肺癌，肝癌，胃癌，食道癌，直结肠癌，宫颈癌，乳腺癌和鼻咽癌。如不加以控制癌症死亡率20年内将翻番。心脑血管病是国人的第一杀手 心脑血管病是国人的第一杀手 人类的第一杀手在历史上不是固定不变的，不同国家和时间第一杀手也可不同。瘟疫和战争都曾占据过第一杀手的位置，它反映了人类的历史沧桑和文明进步。 上世纪末，心血管疾病被多数学者认为是中国和大多数国家的第一杀手，这一观点统治了比较长的时间。 本世纪初，由于癌症发病率的急剧升高，癌瘤是国人第一杀手的观点开始形成和扩散， 2005年4月15日当时的中国卫生部疾病控制司孔灵芝处长说，目前癌症死亡已经超越心血管疾病位于我国各类死因的第一位，成为中国人的第一杀手。 更权威的观点则是心脑血管疾病是当前人类的第一杀手。null43.8%22.3%慢性阻塞性肺病 From He J. et al., N Engl J Med, (2005), 353: 1124-1134.null二. 基因诊断1 基因和基因诊断的概念1 基因和基因诊断的概念1.基因是携带有遗传信息的DNA片段。蛋白质是生命活动的物质基础，蛋白质是基因的表达产物。 2.利用分子生物学的原理和实验技术，以探查导致相关疾病发生和发展的DNA结构变异为中心内容的诊断疾病的技术和方法称为基因诊断。2 基因诊断的重要性2 基因诊断的重要性1.除外伤性疾病外，所有的疾病都是遗传因素和环境因素相互作用的结果。 2.随着营养性疾病和传染性疾病的减少和控制，遗传性疾病的防治日显重要。 3.正确诊断是实施有效治疗的基础和保证。3 基因诊断技术的多样性3 基因诊断技术的多样性1.基因变异的多样性 2.基因诊断技术的多样性 3.聚合酶链反应（PCR） 4.PCR-RFLP 5.PCR-SSCP 6.DNA测序 基因变异的多样性基因变异的多样性1.遗传疾病的致病基因和易患基因都是相应的正常基因突变产生的。 2.染色体的结构与数目，如由于21号染色体增多(三倍体)导致的先天愚型。 3.基因缺失，如α地中海贫血。 4.基因片段的插入与缺失 5.基因点突变：同义突变，错义突变，无义突变，移码突变，终止密码突变和非编码区的突变等等。 基因诊断技术的多样性基因诊断技术的多样性1.基于核酸杂交的基因探针，等位基因特异性寡核苷酸探针（Allele specefic oligonucleotide, ASO)，基因芯片等。 2.基于核酸杂交与电泳的技术，如Southern blot 和Northern blot等等。 3.基于PCR和电泳技术的PCR-RFLP和PCR-SSCP等。 4.基于电泳和免疫技术的免疫印迹（Western blot) 4.常用技术--PCR 4.常用技术--PCR1.聚合酶链反应（PCR）是基于细胞内DNA复制原理而发展建立的细胞外大量复制DNA片段的分子生物学技术。 2.聚合酶链反应（PCR）是基因诊断的基本技术，该技术的建立和 发展为利用相当微量的DNA样品开展基因诊断成为可能。 3.聚合酶链反应（PCR）是开展PCR-RFLP和PCR-SSCP的基础。开展PCR的基本要素开展PCR的基本要素1.基因组(DNA)模板 2.引物 3.DNA聚合酶 4.合成原料dNTP 5.二价镁离子 Mg++ 6.一价离子K+ 7.适合的缓冲液nullnull目的基因扩增片段的鉴定目的基因扩增片段的鉴定5.常用技术-- 电泳5.常用技术-- 电泳1.电泳的概念 2.电泳迁移率 3.电泳应用的广泛性 4.电泳迁移率与DNA 电泳的概念电泳的概念1.带电颗粒在电场中的定向运 动称为电泳 2.开展电泳的必要条件 ⑴外加电场（电泳仪） ⑵样品中颗粒带电（缓冲液） ⑶支持介质（聚丙烯酰胺凝等） ⑷适宜的条件组合电泳迁移率电泳迁移率1.带电颗粒在单位电场强度下的移 动速度称为电泳迁移率 2.影响电泳迁移率的主要因数有 Q: 颗粒所带电荷 r: 颗粒的性质（半径，构型与构象） η: 介质的黏度 支持介质等等 3.M=Q/6πrη电泳应用的广泛性电泳应用的广泛性 电泳是最为重要和应用最为广泛的生物化学和分子生物学技术之一，可以毫不夸张地说没有不应用电泳技术的基因诊断，也没有不应用电泳技术的分子生物学和基因。电泳迁移率与DNA电泳迁移率与DNA1.在非变性聚丙烯凝胶电泳中，双链DNA的电泳迁移率与其链长呈反相关，据此建立了PCR-RFLP技术。 2.在非变性聚丙烯凝胶电泳中，单链DNA的电泳迁移率不仅与其链长有关，更与其构象有关，而构象则与其一级结构有关，据此建立了PCR-SSCP技术。 6. PCR-RFLP 6. PCR-RFLP1.聚合酶链反应-限制酶切片段长度多态性简称PCR-RFLP 2.PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymor-phism) 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶1.定义 2.分类 3.命名 4.酶切位点 5.酶切末端 限制性内切酶--定义 限制性内切酶--定义1.能识别和切割DNA双链内部特异核苷酸序列的一类核酸内切酶。 2.核酸内切酶是原核细胞识别和破坏外源DNA分子的初级免疫形式。 3.原核细胞具有限制性/甲基化系统，通过甲基化保护自身的DNA不被破坏。 限制性内切酶--分类 限制性内切酶--分类1.限制性内切酶可分为三类：Ⅰ类，Ⅱ类和Ⅲ类。 2.基因重组技术中使用的是Ⅱ类。 3.Ⅱ类限制性内切酶的酶切位点多在识别的序列内。 限制性 内切酶--命名限制性 内切酶--命名EcoRⅠ  E co R Ⅰ 核酸内切酶命名一般由四部分组成。 1.第一部分一个斜体的大写英文字母表示源菌的属（Escherichia ）。 2.第二部分二个斜体的小写英文字母表示来源菌的种（ coli ）。 3.第三部分正写英文字母表示来源菌的株R。 4.第四部分大写罗马数字表示发现的顺序Ⅰ。null　　　 限制性核酸内切酶作用后产生两种末端： 　 钝性末端(blunt end) 粘性末端(sticky end) PCR-RFLP PCR-RFLP1.目的基因的扩增 2.扩增片段的酶切 3.酶切产物的电泳 4.多态性（突变）的确定 nullnull扩增血红蛋白特定基因片段扩增血红蛋白特定基因片段1.利用特异性的引物扩增编码血红蛋白β链含有GAA→ GTA突变部位的DNA片段。 2.扩增既含有特定的突变部位又能存在具有鉴别性内切酶的DNA片段是开展PCR-RFLP的关键。 3.当含有突变的部位目前尚不能发现有可用的限制性内切酶时，可以考虑引入错配碱基的方法导入内切酶识别序列。nullMstⅡ酶切识别位点: ↓ ----CCTNAGG---- ----GGANTCC---- ↑ (Glu) ----GGAATCC--- GAA , GAG ↑ (Val) ----GGTATCC--- GUA , GUG † 扩增片段的酶切(A)扩增片段的酶切(A)MstⅡ酶切识别位点: ↓ ----CCTNAGG---- ----GGANTCC---- ↑ HbA ↓ ----CCTTAGG---- ----GGAATCC---- GAA, GAG (Glu) ↑ HbS ----CCATAGG---- ----GGTATCC---- GUA,GUG (Val) 扩增片段的酶切(B)扩增片段的酶切(B)HbA -----CCTTAGG---------∥---------------------CCTTAGG------CCTTAGG- -----GGAATCC---------∥---------------------GGAATCC------GGAATCC- -------∣---------∥-------1.15kbp-------------------∣-----0.2kbp-----∣ HbS ----- CCTTAGG---------∥ --------------------CCATAGG---- CCTTAGG-- ------GGAATCC---------∥---------------------GGTATCC-----GGAATCC- -------∣----------------------------∥-------1.35kbp-----------------------∣nullHb A ↓ ------CCTTAGG----- ------GGAATCC----- ↑ Hbs ------CCATAGG----- ------GGTATCC-----酶切产物的电泳酶切产物的电泳PCR-RFLP应用的关键PCR-RFLP应用的关键1.基因的突变（主要是点突变）与疾病的发生密切相关。 2.能够有效地扩增含有该突变位点的DNA片段。 3.能够寻找到与基因突变相关的限制性核酸内切酶，突变与否能够导致不同的酶切效果。 4.通过电泳能够检测和识别上述不同的酶切效果。多态性（突变）的确定多态性（突变）的确定1.人类基因组含有大于300百万个 SNP（ single nucleotide polymorphism ）位点，其中多数已被确定具有巨大的应用价值。不同的多态性形式可以影响携带者疾病的发生或发展。 2.基因多态性单核苷酸的改变可以利用限制性核酸内切酶多态性技术方法检测，在目前若无限制性核酸内切酶可以利用时，可以在引物合成时通过特定位置导入错配碱基人工形成限制性内切酶位点。碱基错配导入酶切位点碱基错配导入酶切位点国内外的研究显示脂蛋白脂肪酶外显子9存在基因多态性，C1595 G颠换导致Ser447  Stop。C1595G颠换并没有直接影响目前常用的限制性内切酶的识别序列，利用错配碱基引物是导入限制性内切酶识别序列是常用的技术和途径。限制性酶切位点的导入限制性酶切位点的导入 TCA编码丝氨酸 TCAGGCTGGTGAGCATTCTGGGCTA GANTC 为 Hinf Ⅰ识别序列 TGAGGCTGGTGAGCATTCTGGGCTA TGA 为终止密码子 3’- TCAGACCACTCGTAAGACCCGAT-5’ CAGTC 不为Hinf Ⅰ识别和切割 GAGTC 可为Hinf Ⅰ识别和切割外显子9PCR-RFLP外显子9PCR-RFLP1. 利用新引物扩增外显子9产生一 个160bp的片段。 2. Ser447/Ser447经Hinf Ⅰ处理为160bp 3. Stop447/Stop447经Hinf Ⅰ处理137bp 4. Ser447/Stop447经Hinf Ⅰ处理160/137bp外显子9PCR-RFLP外显子9PCR-RFLPC/CG/GG/CG/CPCR-RFLP的特点与应用PCR-RFLP的特点与应用1.该方法操作简便，结果可靠，便于推广应用。 2.该方法只能用于筛查影响内切酶识别序列有关的多态性（突变）部位，不能发现与内切酶识别序列无关部位的改变。 3.该方法的局限性确定该方法主要应用于已知突变有和无的确定（如镰刀性贫血）与基因多态性的筛查（如载脂蛋白E基因多态性的检测）。 PCR-SSCP PCR-SSCP1.聚合酶链反应-单链构象多态性简称为PCR-SSCP 2.PCR-SSCP (Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation polymorphism) 7. PCR-SSCP 7. PCR-SSCP1. 目的基因的扩增 2. 扩增片段的变性 3. 变性基因片段的电泳 4. 正常和异常电泳带的确认 5. DNA测序的证实 目的基因的扩增目的基因的扩增1.利用聚合酶反应扩增认为有可能发生基因突变的目的基因片段。目的基因片段的选择首先是根据文献选择比较高发的部位，其次尽可能扩增较多的片段。 2.PCR-SSCP的检出率与扩增片段的长短有关，扩增片段太短无疑大大降低了检测的效率，提高了检测的成本；扩增片段太长则降低了突变的检出率，往往是得不偿失。一般提倡扩增片段在200-400bp之间。null扩增片段的变性扩增片段的变性1.扩增的目的基因片段，除非存在大片段的插入或缺失，否则长度基本或完全相同，这些扩增片段的双链电泳迁移率基本或完全相同，即使含有一个或几个可能的点突变也不能通过电泳有效地检出突变。 2.相同长度的基因片段即使仅有一个碱基的改变，也会影响其单链的构象并进而影响其电泳迁移率有可能被检出。 3.可以通过物理的热变性（加热）和化学试剂（甲酰胺）的促变性完成变性。同时可以通过急剧降温防止复性。 单一碱基突变对单链构象的影响 单一碱基突变对单链构象的影响T33C33↗↗变性基因片段的电泳变性基因片段的电泳1.PCR-SSCP基因突变的检出不仅与基因突变导致的电泳迁移率改变大小有关，更与电泳的条件有关。因此不仅选用检出灵敏度高的聚丙烯凝胶电泳，而且电泳的距离（长度）也较大。此外凝胶的浓度（C）、交联度（T）和电泳的温度、甘油与二甲基亚砜等试剂存在与否也可能影响突变的检出率。 2.考虑到电泳时间较长和温度可能影响电泳迁移率一般多利用恒温电泳。 3.为了提高电泳的灵敏度凝胶染色多使用核酸的硝酸银染色。异常电泳带的确认异常电泳带的确认1.在PCR-SSCP基因突变的检测中，基因突变的检测就是异常电泳带的确认。 2.由于突变的发生相对罕见，因此电泳中多数检测样品的电泳图型就是检测异常的参考标准。 3.异常电泳图型可以表现为异常电泳条带。其形式可以是“快带”，也可以是“慢带”。 4.通过异常电泳条带的判断，可以初步确定是突变杂合子或突变纯合子。null↓↓↓DNA测序的证实DNA测序的证实1.在PCR-SSCP基因突变的检测中，只能确认基因突变在检测的扩增DNA片段中的有无，既不能判断突变发生的位置，更不能确定突变的类形（插入、缺失或点突变）和形式（插入和缺失的多少或点突变碱基的内容）。 2.在PCR-SSCP基因突变的检测中发现的基因突变需要DNA测序确定，同时通过DNA测序确定突变的类型和形式。null↓ DNA测序 DNA测序1.DNA测序技术有多种，现在已经实现了应用计算机的全自动DNA测序。伴随应用的普及，实现了快速，准确和经济。 2.实验室DNA测序应用广泛的是双脱氧DNA测序技术。该技术是PCR扩增技术和电泳技术的巧妙结合。null3.5 基因诊断实例3.5 基因诊断实例1.利用PCR-RFLP技术对镰刀状 红细胞贫血的基因诊断。 2.利用PCR-SSCP技术为一名严 重高甘油三酯血症患者进行基 因诊断。 3.利用PCR-RFLP技术检测载脂 蛋白E的基因多态性。镰刀状细胞贫血的产前诊断镰刀状细胞贫血的产前诊断 LPL基因突变的诊断 LPL基因突变的诊断1.正常血浆清澈透明，甘油三酯（TG）水平低于1.7mmol/L （150 mg/dl） 2.本病例血浆明显混浊静置后可出现“奶油盖”，高达36mmol/ L（3200mg/dl）null确定入选测定人员(404名)  血浆 空腹肘静脉采血EDTA抗凝全血   血脂测定 TKM法提取基因组DNA （TG,TC和HDLc）  PCR扩增LPL基因片段 （调节区，编码外显子和部分内含子）  琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增效果  扩增基因片段加热变性进行电泳（SSCP）  电泳凝胶硝酸银染色  电泳图谱异常样品进行DNA测序  （外显子9进行RFLP） 探讨基因突变与血脂水平的可能关系 （条件允许进行家系调查）  420例血脂正常人群Ser447Stop 对血脂水平影响的研究 null 表1 引物序列及退火温度脂蛋白脂肪酶外显子5 PCR--SSCP脂蛋白脂肪酶外显子5 PCR--SSCP分子病--脂蛋白脂肪酶变异分子病--脂蛋白脂肪酶变异1.正常人脂蛋白脂肪酶第207位氨基酸残基为脯氨酸（Pro），由外显子5的157--159核苷酸（CCG）编码: 2.正常人 CCG---Pro CCG---Pro 3.本例患者 CCG---Pro CTG---Leu LPL外显子5的测序CCGPro→CTGLeuLPL外显子5的测序CCGPro→CTGLeuT A C C C G----ProT A C C C G----Pro T A C C C/T G----Pro/Leu T A C C C/T G----Pro/Leu外显子5野生型与突变型的比较 C C G C C/T G外显子5野生型与突变型的比较 C C G C C/T GPro207→Leu先证者家系分析Pro207→Leu先证者家系分析Pro207→Leu先证者家系分析Pro207→Leu先证者家系分析外显子3 SSCP电泳图外显子3 SSCP电泳图外显子3扩增片段正向测序结果 外显子3扩增片段正向测序结果 外显子3扩增片段反向测序结果 外显子3扩增片段反向测序结果 null外显子4 SSCP电泳图外显子4 SSCP电泳图内含子3 DNA测序图内含子3 DNA测序图外显子9 SSCP电泳图外显子9 SSCP电泳图外显子9C/C(Ser447Ser)野生型外显子9C/C(Ser447Ser)野生型C外显子9G/G(stop447stop)纯合型外显子9G/G(stop447stop)纯合型G 外显子9C/G(Ser447stop)杂合型外显子9C/G(Ser447stop)杂合型G/CRFLP和SSCP的比较RFLP和SSCP的比较1.检测的目的：突变与多态性 2.电泳的样品：双链与单链 3.检测的范围：限制性内切酶识别位点 扩增的DNA片段全长 4.扩增片段的要求： 限制性酶切位点 200-400bp之间 5.技术的难易： 6.DNA测序的依赖：null三. 基因治疗null1.基因治疗的基本概念 2.基因治疗成功的先例 3.基因治疗失败的教训 4.基因治疗的的基本条件 5.基因治疗的基本过程 6.基因治疗的前景1. 基因治疗的基本概念1. 基因治疗的基本概念 经典的基因治疗就是通过特定的载体把正常或野生基因转移到患者的靶细胞，进行基因修饰或表达以达到改善和治疗疾病的一种现代生物医学的新技术方法。 骨髓和器官移植实质上也可以认为是广义的基因治疗。2. 基因治疗成功的先例2. 基因治疗成功的先例世界首例基因治疗成功的病例:腺苷脱氨酶缺陷症(严重的混合性免疫缺陷症)的治疗 晚近的利伯先天性黑朦（Leber congenital amaurosis, LCA）失明患者的复明。 我国的血友病的成功治疗 首例基因治疗的成功病例首例基因治疗的成功病例1. 时间：1990年9月14日 2. 病例：患严重混合型免疫缺陷综合症 的四岁美国女孩。　 3. ADA基因位于20q 欧美发病率1/10万 4. 由于受转染的是分化的T淋巴细胞，治疗需 要大约每月重复一次。至1991年5月经多次 基因治疗，体内的ADA 活性已达到正常值 的25%，并未见明显的副作用，从此她开 始了正常人的生活。 SCID的基因治疗SCID的基因治疗时间： 1990年的9月14日 单位：美国国立卫生研究院（NIH） 医师： W. French Anderson博士 患者： 4岁女孩Ashanthi DeSilva 疾病：重度联合免疫缺陷综合征 （severe combined immunodeficiency, SCID）。null 腺苷脱氨酶缺乏症 腺苷脱氨酶缺乏症1.腺嘌啉核苷酸的分 解代谢 2.腺苷脱氨酶的功能 3.腺苷脱氨酶缺乏的 影响 4.常染色体隐性遗传 5.人类第一个成功基 因治疗的疾病ADA的基因治疗ADA的基因治疗1.克隆具有生物学功能的人ADA基因。 2.将ADA基因与基因病毒载体相连接。 3.从患儿机体抽取和分离靶细胞—淋巴细胞。 4.将携带有人ADA基因的病毒感染淋巴细胞，完成基因的转移。 5.检测和分离具有ADA基因功能的淋巴细胞，并确认其安全可靠。 6.将安全可靠并具有功能的淋巴细胞回输到患儿身体。治疗过程治疗过程 在这次基因治疗中，科学家从Ashanthi身上抽取血液并分离得到少量 白细胞，进行体外培养扩增。然后，他们利用改造后的逆转录病毒将正常的人ADA基因转移到靶细胞里，使白细胞代偿性地表达了ADA蛋 白。十天以后，这种经过“修饰”的白细胞通过静脉缓缓地输回到女孩体中。通过这种治疗方式，Ashanthi的免疫系统功能提高了40%以上。治疗结果治疗结果 由于那些经过遗传改造的细胞只能正常工作几个 月，所以这并没有完全治愈Ashanthi，其后必须要反复重复这个治疗过程，才能保证免疫系统继续工作。至今，Ashanthi的健康状态一直保持良好，她甚至开始读大学了。小女孩彻底告别了 与世隔绝的无菌病房，走进了阳光灿烂的新生活。 晚近成功基因治疗的病例晚近成功基因治疗的病例 2008年4月28日：英研究人员首次利用基因疗法改善了一名先天失明患者的视力。英国伦敦大学医学院及摩尔菲尔兹眼科医院的研究人员成功开展了一项临床实验，首次革命性地采用基因疗法改善了一位18岁的先天失明患者Steven Howarth的视力。他们指出，这种治疗方法十分安全有效。此项研究是基因疗法技术的一大里程碑，它将对眼部疾病治疗产生深远的影响。nullnull利伯先天性黑朦利伯先天性黑朦利伯先天性黑朦（Leber congenital amaurosis, LCA）,是一种由单个基因突变引起的遗传性疾病。这种病在幼年时期就开始影响视力，病人在40岁就会完全失明。研究 人员认为这种病的其中一种形式由视网膜色素上皮细胞65（retinal pigment epithelium 65, RPE65） 基因突变造成。RPE65编码的蛋白能够将维生素A转化为能被视网膜感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）利用的形式，以产生视紫红质。视紫红质为可吸收光的色 素物质。如果没有视紫红质，这些感光细胞最终将会死亡。导致患者最终完全失明。2001年，研究人员报道，往携带RPE65基因突变的伯瑞犬的视网膜细胞插入功能性RPE65基 因拷贝，能恢复其光感受器的功能。接受基因疗法治疗后，这些伯瑞犬可以避开障碍物，走出迷宫（ScienceNOW, 27 April 2001）。 我国的基因治疗我国的基因治疗复旦大学遗传所与第二军医大学长海医院合作,曾对血友病B患者进行基因治疗,使用携带有人Ⅸ因子基因的反转录病毒载体转染培养中的皮肤成纤维细胞,分泌Ⅸ因子的自体成纤维细胞包埋于胶原并注入患者皮下,患者Ⅸ因子的水平从70ug /L 上升到240ug/L,凝血活性由2.9%上升至6.3%.临床症状明显改善。我国的基因治疗我国的基因治疗2003年10月中国国家食品药品监督管理局批准了基因治疗药物“今又生”的商业化销售，成为世界上第一例国家批准的基因治疗药物。到2005年底，全国22个省市150多家三甲医院的3100多名病人接受了该药物的治疗，治疗的恶性肿瘤达43种，表明其抗癌具有广谱性。 2005年11月，第二个基因治疗药物——重组人p53腺病毒注射液H101又获国家一类新药许可。H101主要用于治疗鼻咽癌等头颈部肿瘤，并对非小细 胞肺癌、肠癌、软骨肉瘤等癌症具有明显疗效。P53 的治疗价值P53 的治疗价值今又生 通用名：重组人p53腺病毒注射液 英文名：Recombinant Human Ad-p53 Injection  汉语拼音：Chongzuren p53 Xianbingdu Zhusheye  注册商标：今又生（Gendicine）  主要组成成分：重组腺病毒-p53基因颗粒  [性状] 本品为淡白色澄明液体null3. 基因治疗失败的教训3. 基因治疗失败的教训 1999年9月17日美国费城青年盖辛格接受腺病毒载体的基因治疗因全身免疫反应导致多脏器衰竭而最终死亡，年仅18岁。这不仅引发了全球性的大辩论，同时使美国的FDA下令暂停宾夕法尼亚大学的8项基因治疗实验。null4. 基因治疗的基本条件4. 基因治疗的基本条件１. 基因诊断明确 ２. 现行的治疗方法无效或欠佳 ３. 相关基因的克隆、载体的构建和基因 转移等技术已经相当成熟。 ４. 较低的表达水平足可以治疗疾病。 ５. 基因转移有效性和安全性的检测系统 已经建立。 ６. 动物实验的验证。5. 基因治疗的基本过程5. 基因治疗的基本过程1. 病例的选择 2. 基因诊断 3. 目的基因的获得与扩增 4. 靶细胞的选择与分离 5. 载体的选择与构建 6. 目的基因与载体的连接 7. 基因转移 8. 疗效的观察与确定null基因转移技术基因转移技术基因转移的物理学方法: 基因注射,电穿孔等. 基因转移的化学方法: 氯化钙转移法,脂质体转移法等. 基因转移的生物学方法: 逆转录病毒载体, 腺病毒载体, 其他病毒载体逆转录病毒载体的优点逆转录病毒载体的优点1. 结构简单，遗传背景清楚 2. 病毒基因可在真核细胞表达 3. 可以获得高病毒滴度 4. 可选择性的进入靶细胞 5. 感染效率高逆转录病毒载体的缺点逆转录病毒载体的缺点１. 靶细胞必须处于增殖状态 ２. 外源基因容量有限（～９ kb） ３. 重组病毒的滴度较低 ４. 感染靶细胞的特异性不高病毒载体的安全性病毒载体的安全性１. 总体来说，病毒载体是安全的。 ２. 逆转录病毒携带基因整合到靶 细胞基因是随机的，理论上有 激活癌基因的可能。 ３. 许多病毒是致病的，科研史上 有基因治疗使接受者死亡的先 例。逆转录病毒的基本结构逆转录病毒的基本结构1. 两端有长末端重复序列（LTR），其中包括启动子，增强子和整合到目的基因中所需的序列。 ２.结构基因：核壳蛋白基因（gag），逆转录酶基因（pol）和外壳蛋白基因（env） 3. 包装信号序列（psi,ψ）nullnullnull逆转录病毒载体的缺点逆转录病毒载体的缺点１. 逆转录病毒中逆转录酶的存在 的意义,为逆转录提供了可能. ２. 在基因治疗中不能造成病毒的反 复感染,甚至造成疾病. ３. 要兼顾上述两个问题,要扬长补短, 优势互补.nullnullnullnullnull6. 基因治疗的前景6. 基因治疗的前景基因治疗是医学临床领域的一项革命和创新，为临床医学许多目前尚无有效治疗疾病的患者带来福音和希望。 基因治疗既有成功的先例，同时也有失败的惨痛教训。基因治疗的改进和出路在于分子生物学理论的突破和实验技术的创新。 目前我们不能因成功的先例盲目崇拜基因治疗，也不能因失败的教训而放弃基因治疗。基因治疗具有无限光明的前途。Questions?Questions?1.何谓基因？举例基因与疾病的关系。 2.何谓基因诊断？何谓PCR-RFLP和PCR -SSCP？简述PCR-RFLP和PCR -SSCP技术的基本原理和操作过程。并 简要讨论该两种基因诊断技术的应用特 点和各自的优缺点。 3.何谓基因治疗？结合所学基因治疗的知 识，谈一谈你对基因治疗现状的认识和 对其将来的展望。null谢谢 光临