高效液相色谱方法开发（安捷伦科技）

HPLC Method Development April, 2007 高效液相色谱 方法开发 使用新的色谱柱加快 方法开发速度 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 2 常见的方法开发途径 1. 按照“方法开发指南”按步操作–基于选择性改变参 数–比如: pH值, 色谱柱，流动相等 2. 使用方法开发软件–运行几个预设方法最后选用结果 最好的一个方法 3. 在多种色谱柱及多种流动相下测试并比较结果，最后 选用最好的一个方法 ＃很多人采用途径1进行方法开发。 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com WYL 线条 WYL 线条 HPLC Method Development April, 2007 Page 3 常见的方法开发从哪里开始? 1. 选择C18键合相 –种类很多，不同的键合特点 a) 一根短的色谱柱可以减少方法开发时间 b) 较小的色谱柱填料粒径可以在短时间内提高所需的分离度 c) Eclipse Plus C18色谱柱可以改进分离结果–更好的柱效和峰形 2. 选择简单的流动相 –可靠，并适用多种样品 a) 水相：磷酸缓冲液 pH 3, 三氟乙酸, 或甲酸 b) 有机相：乙腈或甲醇 3. 调速流动相得到更理想的保留和分离度 a) 所有的峰有适当的分离度(Rs ³ 2.0) –相应较高的柱效 b) 第一个峰的保留值最好至少等于1 c) 分离时间在20分钟内 –更短 d) 更新的色谱柱选择，小粒径更短的色谱柱可以在短时间内提高分离度及柱效，加 快方法开发速度 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com WYL 线条 HPLC Method Development April, 2007 Page 4 分离度 a 选择性–受流动相和固定相的影响 N 柱效 –受柱长和颗粒度的影响 k 保留因子 (保留) –受固定相和流动相，梯度斜率和延迟体积(梯度)的 影响 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 5 常见的方法开发参数 –选择性，柱效，保留值对分离度的影响 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Re so lu tio n Increase N Increase Alpha Increase k' 选择性最影响分离度 • 改变键合相 • 改变流动相 • 柱效是最容易预测的因素 Rs = N½/4 · (a-1)/a · k’/(k’+1) Plates: 5000 10000 15000 20000 25000 Alpha: 1.10 1.35 1.60 1.85 2.1 k’: 2.0 4.5 7.0 9.5 12.0 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 6 选择性 －－选择性 α细微的差异可以使得分离度上有较大的不同 Eclipse Plus C8 Greatest Resolution for this sample Eclipse XDB-C8 Eclipse Plus C18 α Resolution peaks 1,2 1.43 4.15 peaks 2,3 1.29 3.55 α Resolution peaks 1,2 1.33 3.55 peaks 2,3 1.31 3.82 α Resolution peaks 1,2 1.68 6.12 peaks 2,3 1.4 4.97 caffeine barbital sulfam ethoxazole Cols: 4.6 x 150, 5 um m.p.: 40% MeOH, 60% water min0 1 2 3 4 min0 1 2 3 4 min0 1 2 3 4 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 7 在最开始时如何制定方法开发? 流动相 (改变的第一选择，因为最易行) • 流动相 –有机相 (乙腈, 甲醇等) • 流动相 – pH –在一个更宽的pH范围 –有时会是pH 1-12 键合相 (提供多种最优化方法的可能) • 很多种选择 C18 – C8, Phenyl, CN等 • AQ 柱可以用于高水相的流动相体系 • 选择新的色谱柱得到更好的峰形 使用两个重要参数改变选择性以提高分离度 –流动相和键合相 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com WYL 线条 HPLC Method Development April, 2007 Page 8 好的液相色谱柱所应具备的性能 好的峰形 • 尤其对于碱性化合物, • 可以不加额外的流动相添加剂 • 减小拖尾因子以提高分离度和定量准确性 高的柱效 • 1.8um, 3.5um和5um，不同的颗粒粒径可以满足任何分离的柱效 • 柱效N –采用柱效进一步优化分离度 好的选择性 • C18是最受欢迎的键合相，且适用于大部分化合物的分离 • C8 是在C18之后的受欢迎的键合相 在较宽的流动相范围内均可使用 • 简化方法开发 • 适于更多的应用 出色的重现性 –不同批次的色谱柱都有很好的重现性 好的使用寿命 –至少能分析 1000 个样品 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 9 采用新的色谱柱进行方法开发 1.小颗粒的更短的色谱柱 – 1.8um粒径的高分离度快速液相色谱柱 (RRHT) –采用50mm或更短的柱长 可以用于快速的方法开发 – 较长的色谱柱可以提高柱效 – 11种键合相可供选择 2. 改进的键合相可以提供更好的结果 – 更好的峰形和柱效可以提高分离度 – 对于建立好的方法至关重要 – 新的Eclipse Plus 色谱柱可以提供更好的峰形 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 10 一根色谱柱可以满足很多分离要求吗? 是! 新的 ZORBAX Eclipse Plus色谱柱可以做到! • 与其它厂商相比，有更好的结果！ PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 11 ZORBAX Eclipse Plus 色谱柱 ZORBAX Eclipse Plus 色谱柱: Ø使用ZORBAX 硅胶–采用更好 的专利技术处理硅胶 Ø采用改进的键合试剂及键合过 程 Ø更加严格的质控，批与批 之间更加好的重现性 CH CH CH CH CH CH O SiO O O O Si Si Si CH CH CH CH CH CH Si 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 改进 的硅 胶 基质 改进的双封 端技术 更好的峰形 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com WYL 线条 HPLC Method Development April, 2007 Page 12 改进所带来的好处: 更好的峰形 •对于大部分的碱性化合物 •对于大部分的流动相 –无需额外的添加剂 •与其它色谱柱相比 对于除了碱性化合物之外的样品同样也有更好的 峰形和更好的柱效 •酸碱混合物 •中性化合物 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 13 Eclipse Plus C18 – 分离碱性化合物时没有拖尾 –标准测试混合样品1 Eclipse Plus C18 Ace 5 C18 Discovery HS C18 Gemini C18 Luna C18(2) SunFire C18 XTerra MS C18 XBridge C18 min0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 1. 吡啶 (碱) 2. 酚(酸) 流动相: 60/40 水/乙腈 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 14 ZORBAX Eclipse Plus 在甲醇和磷酸盐流动相中分离阿米替林峰形最好 Eclipse Plus C18 Phenomenex Gemini C18 Phenomenex Luna C18 (2) Waters SunFire C18 Ace C18(2) Inertsil ODS (3) Tf = 1.00 Tf = 1.25 Tf = 1.26 Tf = 1.20 Tf = 1.92 Tf = 1.11 Amitriptyline ~ 0.1µg 80% Methanol 8mM total Potassium Phosphate Buffer pH 7.0, Detection: UV 215 nm, Flow Rate: 1.0 mL/min Columns: 4.6x100mm 5µ columns Peak Shape is normally better in Methanol mobile phases. Eclipse Plus is superior under these conditions. PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 15 Eclipse Plus 在中等pH范围没有三乙胺添加剂下也可以提供更好峰形 Eclipse Plus C18 4.6 x 75 mm 3.5 µm Eclipse XDB-C18 4.6 x 75 mm 3.5 µm 1. Famotidine 2. Cimetidine 3. Pirenzipine Conditions: Columns: As listed Mobile Phase.: 20% MeOH, 80% 20 mM phosphate pH 7.0 Flow Rate =1 mL/min. Detection: UV 254 semi micro flow cell N=7800 TF: 1.05N=7800TF: 1.00 N=5700 TF: 1.12 N=4300 TF: 1.74 min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 High efficiency with a 3.5um particle is easily achieved with Eclipse Plus No mobile phase modifiers are needed for perfect performance! PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 16 1. 采用RRHT进行快速方法开发： 采用短的RRHT C18色谱柱在短时间内得到更高柱效 RRHT SB-C18 4.6 x 50mm, 1.8 um min0.5 1 1.5 2 2.5 RRHT SB-CN 4.6 x 50mm, 1.8 um 1,2 43 min0.5 1 1.5 2 2.5 Column: 4.6 x 50mm, 1.8um Mobile Phase: A= 0.1% Formic Acid, B=ACN + 0.1%Formic Acid (95:5) Flow rate: 1.5 mL/min Inj. Vol: 2 ul Sample: Xanthines: 1. 1-methylxanthine, 2. 1,3-dimethyluric acid, 3. 3,7-dimethylxanthine, 4. 1,7-dimethylxanthine 1 2 3 4 ØThe C18 gives the most effective resolution – and with a 4.6 x 50mm, 1.8um column the initial results are achieved in just a couple of minutes, with the highest efficiency. ØThe 50mm length is short and fast – methods can be approximated or completed in just minutes!! PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 17 1. 采用RRHT进行快速方法开发: 不同的 ZORBAX RRHT C18键合相所具有的不同的选择性 Eclipse Plus C18 Eclipse XDB-C18 Extend-C18 StableBond SB-C18 Mobile phase: (69:31) ACN: water Flow 1.5 mL/min. Temp: 30 °C Detector: Single Quad ESI positive mode scan Columns: RRHT 4.6 x 50 mm 1.8 um Sample: 1. anandamide (AEA) 2. Palmitoylethanolamide (PEA) 3. 2-arachinoylglycerol (2-AG) 4. Oleoylethanolamide (OEA) 1 2 3 4 1 2 3 4 5 1 2 3 4 1 2 3 4 5 1 2,3 4 1 2 3 4 5 1 23 4 min1 2 3 4 5 不同的键合相具有不同的 选择性，根据所分析的样 品选择适合的键合相。 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com HPLC Method Development April, 2007 Page 18 方法开发的起始步骤 Ø选择一根性能优越的 C18或 C8键合 相作为方法开发的起始，这个键合相应 对酸性、碱性及中性化合物都可以提供 好的峰形和保留。 Ø优化流动相中有机相的组成以改变其 选择性。 Ø如果必需的话，选择不同的键合相来 完成方法的优化。 Ø当pH在1-2时，选择 SB-C18 如果使用新的RRHT色谱柱，这些步骤 可以很快地完成，使得寻找最佳方法变 得更为容易。 •低 pH •调节 %ACN for 0.5